Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik. İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında məhdud CSS dəstəyi var. Ən yaxşı təcrübə üçün sizə yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyi tövsiyə edirik (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq rejimini söndürün). Bu arada, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün biz saytı üslub və JavaScript olmadan təqdim edəcəyik.
Termofillər yüksək temperaturda inkişaf edən mikroorqanizmlərdir. Onları öyrənmək həyatın ekstremal şəraitə necə uyğunlaşdığı barədə dəyərli məlumat verə bilər. Bununla belə, adi optik mikroskoplarla yüksək temperatur şəraitinə nail olmaq çətindir. Yerli rezistiv elektrik isitməsinə əsaslanan bir neçə evdə hazırlanmış həllər təklif edilmişdir, lakin sadə kommersiya həlli yoxdur. Bu yazıda biz istifadəçinin mühitini mülayim saxlamaqla termofil tədqiqatları üçün yüksək temperatur təmin etmək üçün mikroskopun baxış sahəsi üzərində mikromiqyaslı lazer qızdırması konsepsiyasını təqdim edirik. Orta lazer intensivliyində mikromiqyaslı istilik biouyğun və səmərəli işıq uducu kimi qızıl nanohissəciklərlə örtülmüş substratdan istifadə etməklə əldə edilə bilər. Mikromiqyaslı maye konveksiyasının, hüceyrənin saxlanmasının və mərkəzdənqaçma termoforetik hərəkətinin mümkün təsirləri müzakirə olunur. Metod iki növdə nümayiş etdirilmişdir: (i) Geobacillus stearothermophilus, aktiv termofilik bakteriya, təxminən 65°C-də çoxalır, onun mikromiqyaslı istilik altında cücərdiyini, böyüdüyünü və üzdüyünü müşahidə etmişik; (ii) Thiobacillus sp., optimal hipertermofil arxe. 80°C-də. Bu iş müasir və əlverişli mikroskopiya alətlərindən istifadə etməklə termofil mikroorqanizmlərin sadə və təhlükəsiz müşahidəsinə yol açır.
Milyardlarla il ərzində Yerdəki həyat bəzən bizim insan nöqteyi-nəzərimizdən ekstremal hesab edilən geniş ətraf mühit şəraitinə uyğunlaşmaq üçün təkamül etmişdir. Xüsusilə, termofil adlanan bəzi termofil mikroorqanizmlər (bakteriyalar, arxeyalar, göbələklər) 45°C-dən 122°C1, 2, 3, 4-ə qədər olan temperatur intervalında inkişaf edir. Termofillər müxtəlif ekosistemlərdə, məsələn, dərin dəniz hidrotermal kanallarında, isti bulaqlarda yaşayırlar. və ya vulkanik ərazilər. Onların araşdırmaları son bir neçə onillikdə ən azı iki səbəbə görə böyük maraq doğurub. Birincisi, biz onlardan öyrənə bilərik, məsələn, termofillər 5, 6, fermentlər 7, 8 və membranlar 9 belə yüksək temperaturda necə dayanıqlıdırlar və ya termofillər ifrat dərəcədə radiasiyaya necə tab gətirə bilirlər10. İkincisi, onlar yanacaq istehsalı13,14,15,16, kimyəvi sintez (dihidro, spirtlər, metan, amin turşuları və s.)17, biomədənçilik18 və termostabil biokatalizatorlar7 ,11 kimi bir çox mühüm biotexnoloji tətbiqlər üçün əsasdırlar1,11,12, 13. Xüsusilə, hal-hazırda məşhur olan polimeraza zəncirvari reaksiya (PZR)19 kəşf edilən ilk termofillərdən biri olan termofil Thermus aquaticus bakteriyasından təcrid olunmuş fermenti (Taq polimeraza) əhatə edir.
Bununla belə, termofillərin tədqiqi asan məsələ deyil və heç bir bioloji laboratoriyada doğaçlama edilə bilməz. Xüsusilə, canlı termofilləri heç bir standart işıq mikroskopu ilə, hətta adətən 40°C-ə qədər aşağı temperaturlar üçün qiymətləndirilən kommersiya şəraitində mövcud olan istilik kameraları ilə də in vitro müşahidə etmək mümkün deyil. 1990-cı illərdən bəri yalnız bir neçə tədqiqat qrupu özlərini yüksək temperaturlu mikroskopiya (HTM) sistemlərinin tətbiqinə həsr etmişlər. 1994-cü ildə Glukh et al. İstilik/soyutma kamerası anaerobluğu qorumaq üçün bağlanmış düzbucaqlı kapilyarların temperaturuna nəzarət edən Peltier hüceyrəsinin istifadəsi əsasında yaradılmışdır 20 . Cihaz 2 °C/s sürətlə 100 °C-ə qədər qızdırıla bilər ki, bu da müəlliflərə hipertermofil Thermotoga maritima21 bakteriyasının hərəkətliliyini öyrənməyə imkan verir. 1999-cu ildə Horn et al. Hüceyrə bölgüsü/bağlantısını öyrənmək üçün hələ də kommersiya mikroskopiyasına uyğun qızdırılan kapilyarların istifadəsinə əsaslanan çox oxşar cihaz hazırlanmışdır. Uzun müddət nisbi hərəkətsizlikdən sonra effektiv HTM-lərin axtarışı 2012-ci ildə, xüsusən də Horn və digərləri tərəfindən icad edilmiş cihazdan istifadə edən Wirth qrupunun bir sıra sənədləri ilə bağlı yenidən başladı. 15 il əvvəl çoxlu sayda arxeylərin, o cümlədən hipertermofillərin hərəkətliliyi qızdırılan kapilyarlardan istifadə etməklə 100°C-ə qədər olan temperaturda tədqiq edilmişdir23,24. Onlar həmçinin daha sürətli isitmə əldə etmək (müəyyən edilmiş temperatura çatmaq üçün 35 dəqiqə əvəzinə bir neçə dəqiqə) və mühitdə 2 sm-dən çox xətti temperatur gradientinə nail olmaq üçün orijinal mikroskopu dəyişdirdilər. Bu temperatur qradiyenti formalaşdıran cihaz (TGFD) bioloji cəhətdən müvafiq məsafələrdə temperatur qradiyenti daxilində bir çox termofillərin hərəkətliliyini öyrənmək üçün istifadə edilmişdir 24, 25 .
Qapalı kapilyarların qızdırılması canlı termofilləri müşahidə etməyin yeganə yolu deyil. 2012-ci ildə Kuwabara et al. İstiliyədavamlı yapışqan (Super X2; Cemedine, Yaponiya) ilə möhürlənmiş evdə hazırlanmış birdəfəlik Pyrex kameraları istifadə edilmişdir. Nümunələr 110°C-ə qədər qızdırmaq qabiliyyətinə malik, lakin ilkin olaraq bioimaging üçün nəzərdə tutulmayan, kommersiyada mövcud olan şəffaf qızdırıcı plitə (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Yaponiya) üzərinə yerləşdirilib. Müəlliflər 65°C temperaturda anaerob termofilik bakteriyaların (Thermosipho globiformans, ikiqat artım müddəti 24 dəqiqə) səmərəli bölünməsini müşahidə etmişlər. 2020-ci ildə Pulshen et al. Ticarət metal qablarının (AttofluorTM, Thermofisher) səmərəli qızdırılması iki evdə hazırlanmış qızdırıcı elementdən istifadə etməklə nümayiş etdirilmişdir: qapaq və səhnə (PCR maşınından ilhamlanmış konfiqurasiya). Bu birləşmə mayenin vahid temperaturu ilə nəticələnir və qapağın altındakı buxarlanma və kondensasiyanın qarşısını alır. O-ringin istifadəsi ətraf mühitlə qaz mübadiləsinin qarşısını alır. Sulfoskop adlanan bu HTM 75°C27 temperaturda Sulfolobus acidocaldarius şəklini çəkmək üçün istifadə edilmişdir.
Bütün bu sistemlərin tanınmış məhdudiyyəti hava obyektlərinin istifadəsinə qoyulan məhdudiyyət idi, hər hansı bir yağ batırılması belə yüksək temperatur üçün və >1 mm qalınlığında şəffaf nümunələr vasitəsilə təsvir üçün uyğun deyildi. Bütün bu sistemlərin tanınmış məhdudiyyəti hava obyektlərinin istifadəsinə qoyulan məhdudiyyət idi, hər hansı bir yağ batırılması belə yüksək temperatur üçün və >1 mm qalınlığında şəffaf nümunələr vasitəsilə təsvir üçün uyğun deyildi. Obщепризнанным недостатком bütün digər sistemlər tərəfindən istifadə edilən obyektivlər, səbirsiz yüklənmələr, yüksək temperatur və vizualizasiya üçün yüksək temperatur >. Bütün bu sistemlərin tanınan çatışmazlığı hava obyektlərinin istifadəsinin məhdudlaşdırılması idi, çünki hər hansı bir yağın batırılması belə yüksək temperatur üçün və qalınlığı > 1 mm olan şəffaf nümunələr vasitəsilə vizualizasiya üçün uyğun deyildi.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适油浸都不适统的一个公认限制是限制使用毫米厚的透明样品成像。 Bütün bu sistemlərin tanınmış məhdudiyyəti hava daxil olan güzgüdən istifadənin məhdudlaşdırılmasıdır, belə ki, hər hansı bir yağa batırılma belə yüksək temperaturda qalınlığı >1 mm olan şəffaf nümunələrin təsviri üçün yararsızdır. Obщепризнанным недостатком bütün bütün bu sistemlər həyata keçirilir ограниченное использование воздушных объективов, любое иммерсионное погружение в масло непригодно üçün belə yüksək yüksək temperatur və vizualizasiya çerez prozrachnıe obraztsı mm1. Bütün bu sistemlərin tanınmış çatışmazlığı hava linzalarının məhdud istifadəsidir, hər hansı bir yağa batırılma bu cür yüksək temperatur üçün uyğun deyil və qalınlığı > 1 mm olan şəffaf nümunələr vasitəsilə vizuallaşdırılır.Bu yaxınlarda bu məhdudiyyət Çarlz-Orzaq və başqaları tərəfindən qaldırıldı. 28, artıq maraq sisteminin ətrafında istilik təmin edən bir cihaz inkişaf etdirən, lakin daha çox, ITO (indium-qalay oksidi) rezistorunun nazik şəffaf təbəqəsi ilə örtülmüş qapaq şüşəsinin içərisindədir. Şəffaf təbəqədən elektrik cərəyanı keçərək qapaq 75 °C-ə qədər qızdırıla bilər. Bununla belə, müəllif linzaya zərər verməmək üçün obyektivə də qızdırmalıdır, lakin 65 °C-dən çox olmamalıdır.
Bu işlər göstərir ki, səmərəli yüksək temperaturlu optik mikroskopiyanın inkişafı geniş şəkildə qəbul edilməmişdir, çox vaxt evdə hazırlanmış avadanlıq tələb olunur və tez-tez məkan həlli bahasına əldə edilir ki, bu da termofil mikroorqanizmlərin bir neçə nəfərdən çox olmadığını nəzərə alsaq, ciddi bir çatışmazlıqdır. mikrometrlər. Azaldılmış isitmə həcmi HTM-ə xas olan üç problemi həll etmək üçün açardır: zəif məkan ayırdetmə qabiliyyəti, sistem qızdırıldığında yüksək istilik inertiyası və həddindən artıq temperaturda ətrafdakı elementlərin (immersion yağı, obyektiv lens və ya istifadəçinin əlləri) zərərli qızdırılması. ).
Bu yazıda biz rezistiv isitməyə əsaslanmayan termofil müşahidəsi üçün HTM təqdim edirik. Bunun əvəzinə, işığı udan substratın lazer şüalanması ilə mikroskopun baxış sahəsinin məhdud bölgəsində lokallaşdırılmış isitmə əldə etdik. Temperaturun paylanması kəmiyyət faza mikroskopiyasından (QPM) istifadə edilməklə görüntülənmişdir. Bu metodun effektivliyini təqribən 65°C-də çoxalma qabiliyyətinə malik olan hərəkətli termofilik bakteriya Geobacillus stearothermophilus və qısa ikiqat artırma müddəti (təxminən 20 dəqiqə) və 80°C-də optimal şəkildə böyüyən hipertermofil Sulfolobus shibatae (archaea) tərəfindən nümayiş etdirilir. təsvir etmək. Temperaturdan asılı olaraq normal təkrarlanma sürəti və üzgüçülük müşahidə edilmişdir. Bu lazer HTM (LA-HTM) örtüyün qalınlığı və ya obyektiv təbiəti (hava və ya yağa batırma) ilə məhdudlaşmır. Bu, bazarda olan istənilən yüksək keyfiyyətli linzalardan istifadə etməyə imkan verir. O, həmçinin istilik ətalətinə görə yavaş istiləşmədən əziyyət çəkmir (millisaniyə miqyasında ani istiləşməyə nail olur) və yalnız ticarətdə mövcud olan komponentlərdən istifadə edir. Təhlükəsizliklə bağlı yeganə yeni narahatlıqlar cihazın daxilində və ola bilsin ki, qoruyucu eynək tələb edən gözlər vasitəsilə güclü lazer şüalarının (adətən 100 mVt-a qədər) olması ilə bağlıdır.
LA-HTM prinsipi mikroskopun baxış sahəsi daxilində nümunəni yerli olaraq qızdırmaq üçün lazerdən istifadə etməkdir (şəkil 1a). Bunun üçün nümunə işığı udmaq qabiliyyətinə malik olmalıdır. Ağlabatan lazer gücündən (100 mVt-dan az) istifadə etmək üçün biz işığın maye mühit tərəfindən udulmasına etibar etmədik, lakin substratı qızıl nanohissəciklərlə örtməklə nümunənin udulmasını süni şəkildə artırdıq (Şəkil 1c). Qızıl nanohissəciklərin işıqla qızdırılması biotibb, nanokimya və ya günəş işığının toplanmasında gözlənilən tətbiqlərlə termal plazmonika sahəsi üçün əsas əhəmiyyət kəsb edir29,30,31. Son bir neçə il ərzində biz bu LA-HTM-dən fizika, kimya və biologiyada termal plazma tətbiqləri ilə bağlı bir neçə tədqiqatda istifadə etdik. Bu metodun əsas çətinliyi son temperatur profilini göstərməkdir, çünki yüksəlmiş temperatur nümunə daxilində mikromiqyaslı bölgə ilə məhdudlaşır. İki ölçülü difraksiya ızgaralarının (həmçinin çarpaz barmaqlıqlar kimi tanınır) istifadəsinə əsaslanan sadə, yüksək ayırdetməli və çox həssas kəmiyyət faza mikroskopiya üsulu olan dörd dalğa uzunluğunda eninə kəsmə interferometri ilə temperatur xəritəsinin əldə oluna biləcəyini göstərdik. 33,34,35,36. Çapraz ızgara dalğa cəbhəsi mikroskopiyasına (CGM) əsaslanan bu termal mikroskopiya texnikasının etibarlılığı son onillikdə dərc edilmiş onlarla məqalədə nümayiş etdirilmişdir37,38,39,40,41,42,43.
Paralel lazer qızdırıcı, formalaşdırma və temperatur mikroskopunun quraşdırılması sxemi. b Qızıl nanohissəciklərlə örtülmüş örtüyü olan AttofluorTM kamerasından ibarət nümunə həndəsəsi. c Nümunəyə diqqətlə baxın (miqyasda deyil). d vahid lazer şüası profilini və (e) qızıl nanohissəciklərin nümunə müstəvisində simulyasiya edilmiş sonrakı temperatur paylanmasını təmsil edir. f (g) bəndində göstərilən nəticədə temperatur paylanmasının simulyasiyasında göstərildiyi kimi vahid temperatur yaratmaq üçün uyğun olan dairəvi lazer şüası profilidir. Ölçək çubuğu: 30 µm.
Xüsusilə, bu yaxınlarda biz məməlilərin hüceyrələrinin LA-HTM və CGM ilə qızdırılmasına nail olduq və 37-42°C diapazonunda hüceyrə istilik şoku reaksiyalarını izlədik və bu texnikanın tək canlı hüceyrə təsvirinə tətbiq oluna biləcəyini nümayiş etdirdik. Bununla belə, LA-HTM-nin yüksək temperaturda mikroorqanizmlərin tədqiqi üçün tətbiqi birmənalı deyil, çünki məməlilərin hüceyrələri ilə müqayisədə daha ehtiyatlılıq tələb olunur: birincisi, mühitin dibinin onlarla dərəcə (bir neçə dərəcə deyil) qızdırılmasına gətirib çıxarır. güclü şaquli temperatur gradientinə. maye konveksiyası 44 yarada bilər ki, bu da substrata möhkəm bağlanmasa, bakteriyaların arzuolunmaz hərəkətinə və qarışmasına səbəb ola bilər. Bu konveksiya maye təbəqənin qalınlığını azaltmaqla aradan qaldırıla bilər. Bu məqsədlə, aşağıda təqdim olunan bütün təcrübələrdə bakteriya süspansiyonları metal fincanın içərisinə yerləşdirilmiş təxminən 15 µm qalınlığında iki örtük arasına yerləşdirilmişdir (AttofluorTM, Thermofisher, Şəkil 1b,c). Prinsipcə, mayenin qalınlığı isitmə lazerinin şüa ölçüsündən kiçik olduqda konveksiyadan qaçınmaq olar. İkincisi, belə məhdud həndəsə ilə işləmək aerob orqanizmləri boğa bilər (bax. Şəkil S2). Bu problemin qarşısını oksigeni (və ya hər hansı digər həyati qazı) keçirə bilən substratdan istifadə etməklə, örtük içərisində sıxılmış hava qabarcıqlarını buraxmaqla və ya üst örtükdə deşiklər açmaqla (bax. Şək. S1) 45 aradan qaldırmaq olar. Bu işdə biz sonuncu həlli seçdik (Şəkil 1b və S1). Nəhayət, lazer istilik vahid temperatur paylanmasını təmin etmir. Lazer şüasının eyni intensivliyində belə (şəkil 1d) temperaturun paylanması vahid deyil, əksinə, istilik diffuziyasına görə Qauss paylanmasına bənzəyir (şəkil 1e). Məqsəd bioloji sistemlərin tədqiqi üçün baxış sahəsində dəqiq temperaturların müəyyən edilməsi olduqda, qeyri-bərabər profillər ideal deyil və həmçinin bakteriyaların substrata yapışmadıqda onların termoforetik hərəkətinə səbəb ola bilər (bax. Şəkil S3, S4)39. Bu məqsədlə, verilmiş həndəsi sahədə mükəmməl vahid temperatur paylanmasına nail olmaq üçün nümunə müstəvisində halqanın formasına (şəkil 1f) uyğun olaraq infraqırmızı lazer şüasını formalaşdırmaq üçün məkan işıq modulatorundan (SLM) istifadə etdik, istilik diffuziyasına baxmayaraq (şək. 1d) 39 , 42, 46. Mühitin buxarlanmasının qarşısını almaq üçün metal qabın üzərinə üst örtük qoyun (Şəkil 1b) və ən azı bir neçə gün müşahidə edin. Bu üst örtük möhürlənmədiyi üçün lazım olduqda istənilən vaxt əlavə mühit asanlıqla əlavə edilə bilər.
LA-HTM-nin necə işlədiyini göstərmək və onun termofilik tədqiqatlarda tətbiqini nümayiş etdirmək üçün biz optimal böyümə temperaturu 60-65°C olan Geobacillus stearothermophilus aerob bakteriyalarını tədqiq etdik. Bakteriya həmçinin normal hüceyrə fəaliyyətinin başqa bir göstəricisini təmin edən flagella və üzmək qabiliyyətinə malikdir.
Nümunələr (Şəkil 1b) bir saat ərzində 60°C-də əvvəlcədən inkubasiya edilmiş və sonra LA-HTM nümunə saxlayıcısına yerləşdirilmişdir. Bu pre-inkubasiya isteğe bağlıdır, lakin iki səbəbə görə faydalıdır: Birincisi, lazer işə salındıqda hüceyrələrin dərhal böyüməsinə və bölünməsinə səbəb olur (Əlavə materiallarda M1 filminə baxın). Əvvəlcədən inkubasiya olmadan, nümunədə yeni baxış sahəsi hər dəfə qızdırıldıqda bakteriya artımı adətən təxminən 40 dəqiqə gecikir. İkincisi, 1 saat öncəsi inkubasiya bakteriyaların örtüyə yapışmasını artırdı, lazer işə salındıqda termoforez nəticəsində hüceyrələrin baxış sahəsindən kənara çıxmasının qarşısını aldı (Əlavə materiallarda M2 filminə baxın). Termoforez hissəciklərin və ya molekulların temperatur qradiyenti boyunca adətən istidən soyuğa doğru hərəkətidir və bakteriyalar da istisna deyil43,47. Bu arzuolunmaz təsir lazer şüasını formalaşdırmaq və düz temperatur paylanmasına nail olmaq üçün SLM-dən istifadə etməklə müəyyən bir ərazidə aradan qaldırılır.
Əncirdə. Şəkil 2 qızıl nanohissəciklərlə örtülmüş şüşə substratın həlqəvari lazer şüası ilə şüalanması nəticəsində əldə edilən CGM ilə ölçülən temperatur paylanmasını göstərir (Şəkil 1f). Lazer şüasının əhatə etdiyi bütün ərazidə temperaturun düz paylanması müşahidə edilmişdir. Bu zona optimal böyümə temperaturu olan 65 ° C-ə təyin edilmişdir. Bu bölgədən kənarda temperatur əyrisi təbii olaraq \(1/r\) səviyyəsinə düşür (burada \(r\) radial koordinatdır).
dairəvi sahədə düz temperatur profili əldə etmək üçün qızıl nanohissəciklərin təbəqəsini şüalandırmaq üçün həlqəvi lazer şüasından istifadə etməklə əldə edilmiş CGM ölçmələrinin temperatur xəritəsi. b Temperatur xəritəsinin izotermi (a). Lazer şüasının konturu boz nöqtəli dairə ilə təmsil olunur. Təcrübə iki dəfə təkrarlandı (bax: Əlavə materiallar, Şəkil S4).
Bakteriya hüceyrələrinin canlılığı LA-HTM istifadə edərək bir neçə saat ərzində izlənildi. Əncirdə. 3, 3 saat 20 dəqiqəlik filmdən çəkilmiş dörd şəkil üçün vaxt intervalını göstərir (Movie M3, Əlavə Məlumat). Bakteriyaların temperaturun optimal olduğu, 65°C-yə yaxınlaşan lazerin müəyyən etdiyi dairəvi sahədə aktiv şəkildə çoxaldığı müşahidə edilmişdir. Bunun əksinə olaraq, temperatur 10 saniyə ərzində 50°C-dən aşağı düşəndə hüceyrə böyüməsi əhəmiyyətli dərəcədə azaldı.
Lazerlə qızdırıldıqdan sonra müxtəlif vaxtlarda böyüyən G. stearothermophilus bakteriyalarının optik dərinlik təsvirləri, (a) t = 0 dəq, (b) 1 saat 10 dəq, (c) 2 saat 20 dəq, (d) 3 saat 20 dəq. 200 Müvafiq temperatur xəritəsinə əlavə edilmiş bir dəqiqəlik filmdən (Əlavə məlumatda verilmiş M3 film) çıxarılmışdır. Lazer \(t=0\) vaxtında açılır. İntensivlik şəklinə izotermlər əlavə edilmişdir.
Hüceyrə artımını və onun temperaturdan asılılığını daha da ölçmək üçün biz Movie M3 baxış sahəsində ilkin olaraq təcrid olunmuş bakteriyaların müxtəlif koloniyalarının biokütləsinin artımını ölçdük (Şəkil 4). Mini koloniya əmələ gətirən vahidin (mCFU) əmələ gəlməsinin başlanğıcında seçilmiş ana bakteriyalar Şəkil S6-da göstərilmişdir. Quru kütlənin ölçülməsi temperaturun paylanmasının xəritəsini çıxarmaq üçün istifadə edilən CGM 48 kamerası ilə aparılmışdır. CGM-nin quru çəki və temperaturu ölçmək qabiliyyəti LA-HTM-nin gücüdür. Gözlənildiyi kimi, yüksək temperatur bakteriyaların daha sürətli böyüməsinə səbəb oldu (Şəkil 4a). Şəkil 4b-dəki yarı log qrafikində göstərildiyi kimi, bütün temperaturlarda artım eksponensial artımı izləyir, burada məlumatlar eksponensial funksiyadan istifadə edir \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), burada \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – generasiya vaxtı (və ya ikiqat artırma vaxtı), \( g =1/ \tau\) – artım sürəti (vahid vaxtda bölmələrin sayı ). Əncirdə. 4c temperaturdan asılı olaraq müvafiq böyümə sürətini və yaranma vaxtını göstərir. Sürətlə böyüyən mCFU-lar iki saatdan sonra böyümənin doyması ilə xarakterizə olunur, yüksək bakterial sıxlığa görə gözlənilən davranış (klassik maye mədəniyyətlərdə stasionar faza oxşar). Ümumi forma \(g\left(T\right)\) (Şəkil 4c) optimal artım tempi 60-65°C olan G. stearothermophilus üçün gözlənilən iki fazalı əyriyə uyğundur. Verilənləri əsas modeldən istifadə edərək uyğunlaşdırın (Şəkil S5)49 burada \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, bu, ədəbiyyatda göstərilən digər qiymətlərlə yaxşı uyğunlaşır49. Temperaturdan asılı parametrlər təkrarlana bilsə də, \({G}_{0}\) maksimum artım sürəti bir təcrübədən digərinə dəyişə bilər (bax. S7-S9 və M4 filmi). Universal olması lazım olan temperaturun uyğunlaşdırılması parametrlərindən fərqli olaraq, maksimum artım sürəti müşahidə olunan mikromiqyaslı həndəsə daxilində mühitin xüsusiyyətlərindən (qidalı maddələrin mövcudluğu, oksigen konsentrasiyası) asılıdır.
a Mikrobların müxtəlif temperaturlarda böyüməsi. mCFU: Miniatür Koloniya Yaradan Vahidlər. Temperatur qradiyentində böyüyən tək bir bakteriyanın videosundan əldə edilən məlumatlar (M3 filmi). b (a) ilə eyni, yarımloqarifmik miqyas. c Xətti reqressiya (b) əsasında hesablanmış artım sürəti\(\tau\) və yaranma vaxtı\(g\). Üfüqi xəta çubuqları: böyümə zamanı mCFU-ların görünüş sahəsinə genişləndiyi temperatur diapazonu. Şaquli xəta çubuqları: xətti reqressiya standart xətası.
Normal böyüməyə əlavə olaraq, bəzi bakteriyalar bəzən lazerlə isitmə zamanı gözə çarpırdı ki, bu da flagellalı bakteriyalar üçün gözlənilən davranışdır. Əlavə məlumatdakı M5 filmi bu cür üzgüçülük fəaliyyətlərini göstərir. Bu təcrübədə Şəkil 1d, e və S3-də göstərildiyi kimi temperatur qradiyenti yaratmaq üçün vahid lazer şüalanmasından istifadə edilmişdir. Şəkil 5, M5 filmindən seçilmiş iki görüntü ardıcıllığını göstərir ki, bir bakteriya istiqamətli hərəkət nümayiş etdirir, digər bakteriyalar isə hərəkətsiz qalır.
İki vaxt çərçivəsi (a) və (b) nöqtəli dairələrlə işarələnmiş iki fərqli bakteriyanın üzməsini göstərir. Şəkillər M5 filmindən götürülüb (əlavə material kimi verilir).
G. stearothermophilus vəziyyətində, bakteriyaların aktiv hərəkəti (şəkil 5) lazer şüası işə salındıqdan bir neçə saniyə sonra başladı. Bu müşahidə, Mora və başqalarının artıq müşahidə etdiyi kimi, bu termofilik mikroorqanizmin temperaturun artmasına müvəqqəti reaksiyasını vurğulayır. 24. Bakteriyaların hərəkətliliyi və hətta termotaksis mövzusu LA-HTM istifadə edərək daha da araşdırıla bilər.
Mikrob üzgüçülüyünü digər fiziki hərəkət növləri ilə qarışdırmaq olmaz, yəni (i) müəyyən istiqaməti olmayan xaotik hərəkət kimi görünən Broun hərəkəti, (ii) temperatur boyunca müntəzəm hərəkətdən ibarət olan konveksiya 50 və termoforez 43. gradient.
G. stearothermophilus müdafiə kimi mənfi ekoloji şəraitə məruz qaldıqda yüksək davamlı sporlar (spor əmələ gəlməsi) yaratmaq qabiliyyəti ilə tanınır. Ətraf mühit şəraiti yenidən əlverişli olduqda, sporlar cücərir, canlı hüceyrələr əmələ gətirir və böyüməsini bərpa edir. Bu sporlaşma/cücərmə prosesi yaxşı bilinsə də, real vaxtda heç vaxt müşahidə edilməmişdir. LA-HTM istifadə edərək, biz burada G. stearothermophilus-da cücərmə hadisələrinin ilk müşahidəsini təqdim edirik.
Əncirdə. Şəkil 6a, 13 spordan ibarət CGM dəstindən istifadə edərək əldə edilmiş optik dərinliyin (OT) vaxtaşırı şəkillərini göstərir. Bütün toplama vaxtı üçün (15 saat 6 dəq, \(t=0\) – lazerlə qızdırmanın başlanğıcı), 13 spordan 4-ü cücərmiş, ardıcıl vaxt nöqtələrində \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' və \(11\) h \(30\)'. Bu hadisələrdən yalnız biri Şəkil 6-da göstərilsə də, əlavə materialda M6 filmində 4 cücərmə hadisəsi müşahidə edilə bilər. Maraqlıdır ki, cücərmə təsadüfi görünür: ətraf mühit şəraitində eyni dəyişikliklərə baxmayaraq, bütün sporlar cücərmir və eyni vaxtda cücərmir.
8 OT təsvirindən (yağla immersion, 60x, 1.25 NA obyektiv) və (b) G. stearothermophilus aqreqatlarının biokütlə təkamülündən ibarət vaxt fasiləsi. c (b) Böyümə sürətinin xəttini vurğulamaq üçün yarım log miqyasında çəkilmişdir (kesik xətt).
Əncirdə. 6b,c məlumatların toplanmasının bütün dövrü ərzində zaman funksiyası kimi görünüş sahəsində hüceyrə populyasiyalarının biokütləsini göstərir. Şəkildə \(t=5\)h-də müşahidə olunan quru kütlənin sürətli çürüməsi. 6b, c, bəzi hüceyrələrin baxış sahəsindən çıxmasına görə. Bu dörd hadisənin böyümə sürəti \(0,77\pm 0,1\) h-1-dir. Bu dəyər hüceyrələrin normal böyüdüyü Şəkil 3. 3 və 4 ilə əlaqəli böyümə sürətindən yüksəkdir. G. stearothermophilus-un sporlardan artan böyümə sürətinin səbəbi aydın deyil, lakin bu ölçmələr LA-HTM-nin marağını vurğulayır və hüceyrə həyatının dinamikası haqqında daha çox öyrənmək üçün tək hüceyrə səviyyəsində (və ya tək mCFU səviyyəsində) işləyir. .
LA-HTM-in çox yönlülüyünü və onun yüksək temperaturda fəaliyyətini daha da nümayiş etdirmək üçün biz optimal böyümə temperaturu 80°C51 olan hipertermofil asidofil arxe olan Sulfolobus shibatae-nin böyüməsini araşdırdıq. G. stearothermophilus ilə müqayisədə bu arxeyalar da çox fərqli morfologiyaya malikdirlər, uzunsov çubuqlardan (çörəklərdən) çox 1 mikronluq kürələrə (kokklara) bənzəyirlər.
Şəkil 7a CGM-dən istifadə etməklə əldə edilmiş S. shibatae mCFU-nun ardıcıl optik dərinlik təsvirlərindən ibarətdir (Əlavə Materiallarda M7 bədii filminə baxın). Bu mCFU 73°C ətrafında, optimal temperatur 80°C-dən aşağı, lakin aktiv böyümə üçün temperatur aralığında böyüyür. Bir neçə saatdan sonra mCFU-ları arxeyanın mikro üzümləri kimi göstərən çoxsaylı parçalanma hadisələrini müşahidə etdik. Bu OT şəkillərindən mCFU biokütləsi zamanla ölçüldü və Şəkil 7b-də təqdim edildi. Maraqlıdır ki, S. shibatae mCFUs G. stearothermophilus mCFUs ilə müşahidə olunan eksponensial artımdan daha çox xətti artım göstərdi. Hüceyrə artım templərinin təbiəti haqqında uzun müddətdir davam edən müzakirələr 52 olmuşdur: bəzi tədqiqatlar mikrobların ölçülərinə mütənasib (eksponensial artım), digərləri isə sabit sürət (xətti və ya iki xətt artımı) olduğunu bildirirlər. Tzur et al.53 tərəfindən izah edildiyi kimi, eksponensial və (bi)xətti artımı ayırd etmək üçün biokütlə ölçmələrində <6%-lik dəqiqlik tələb olunur ki, bu da əksər QPM üsulları üçün əlçatmazdır, hətta interferometriya da var. Tzur et al.53 tərəfindən izah edildiyi kimi, eksponensial və (bi)xətti artımı ayırd etmək üçün biokütlə ölçmələrində <6%-lik dəqiqlik tələb olunur ki, bu da əksər QPM üsulları üçün əlçatmazdır, hətta interferometriya da var. Cur və dr.53-ə daxil olun, biomassiyanın <6% -dən çoxunu təşkil edir, QPM metodlarının çoxaldılması, interferometriyaların istifadəsinə icazə verilir. Zur et al.53 tərəfindən izah edildiyi kimi, eksponensial və (bi)xətti artımı ayırd etmək üçün biokütlə ölçmələrində <6% dəqiqlik tələb olunur ki, bu da əksər QPM metodları üçün, hətta interferometriyadan istifadə etmək üçün əlçatmazdır.Zur və başqalarının izah etdiyi kimi. 53, eksponensial və (bi)xətti artımı fərqləndirmək üçün biokütlə ölçmələrində 6%-dən az dəqiqlik tələb olunur ki, bu da interferometriyadan istifadə edildikdə belə əksər QPM metodları üçün əlçatmazdır. CGM bu dəqiqliyi biokütlə ölçmələrində sub-pg dəqiqliyi ilə əldə edir36,48.
6 OT təsvirindən (yağla batırılma, 60x, NA məqsədi 1.25) və (b) CGM ilə ölçülən mikro-CFU biokütləsinin təkamülündən ibarət vaxt fasiləsi. Əlavə məlumat üçün M7 filminə baxın.
S. shibatae-nin mükəmməl xətti böyüməsi gözlənilməz idi və hələ ki, məlumat verilməyib. Bununla belə, eksponensial artım gözlənilir, ən azı ona görə ki, zaman keçdikcə 2, 4, 8, 16… hüceyrələrin çoxlu bölünməsi baş verməlidir. Biz belə fərz etdik ki, xətti böyümə, hüceyrə sıxlığı çox yüksək olduqda hüceyrə böyüməsi yavaşladığı və nəticədə hərəkətsiz vəziyyətə çatdığı kimi, sıx hüceyrə qablaşdırılması səbəbindən hüceyrə inhibəsi ilə bağlı ola bilər.
Biz öz növbəsində aşağıdakı beş maraqlı məqamı müzakirə edərək yekunlaşdırırıq: istilik həcminin azalması, istilik ətalətinin azalması, qızıl nanohissəciklərə maraq, kəmiyyət faza mikroskopiyasına maraq və LA-HTM-nin istifadə oluna biləcəyi mümkün temperatur diapazonu.
Rezistiv isitmə ilə müqayisədə, HTM inkişafı üçün istifadə edilən lazer istilik bu işdə təsvir etdiyimiz bir sıra üstünlüklər təklif edir. Xüsusilə, mikroskopun baxış sahəsindəki maye mühitlərdə qızdırma həcmi bir neçə (10 μm) 3 həcmdə saxlanılır. Bu yolla, yalnız müşahidə edilən mikroblar aktivdir, digər bakteriyalar isə hərəkətsiz vəziyyətdədir və nümunəni daha da öyrənmək üçün istifadə edilə bilər – hər dəfə yeni temperaturun yoxlanılması lazım olduqda nümunəni dəyişdirməyə ehtiyac yoxdur. Bundan əlavə, mikromiqyaslı qızdırma geniş temperatur diapazonunun birbaşa tədqiqinə imkan verir: Şəkil 4c 3 saatlıq filmdən (Movie M3) əldə edilmişdir ki, bu da adətən bir neçə nümunənin hazırlanmasını və yoxlanılmasını tələb edir – tədqiq olunan nümunələrin hər biri üçün bir. y təcrübədə günlərin sayını ifadə edən temperaturdur. Qızdırılan həcmin azaldılması mikroskopun bütün ətrafdakı optik komponentlərini, xüsusən də obyektiv lensi otaq temperaturunda saxlayır və bu, indiyə qədər cəmiyyətin üzləşdiyi əsas problemdir. LA-HTM istənilən obyektivlə, o cümlədən yağlı linzalarla istifadə oluna bilər və görüntü sahəsində həddindən artıq temperaturda belə otaq temperaturunda qalacaq. Bu araşdırmada bildirdiyimiz lazer isitmə metodunun əsas məhdudiyyəti yapışmayan və ya üzən hüceyrələrin baxış sahəsindən uzaq ola bilməsi və öyrənilməsinin çətin olmasıdır. Bir neçə yüz mikrondan çox daha böyük temperatur artımına nail olmaq üçün aşağı böyüdücü linzalardan istifadə etmək problemin həlli ola bilər. Bu ehtiyatlılıq məkanın ayırdetmə qabiliyyətinin azalması ilə müşayiət olunur, lakin məqsəd mikroorqanizmlərin hərəkətini öyrənməkdirsə, yüksək məkan qətnaməsi tələb olunmur.
Sistemin qızdırılması (və soyudulması) üçün vaxt şkalası \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) onun ölçüsündən asılıdır, qanuna uyğun olaraq \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), burada \ (L\ ) istilik mənbəyinin xarakterik ölçüsüdür (bizim tədqiqatımızda lazer şüasının diametri \(L\ təqribən 100\) μm), \(D\) ətraf mühitin istilik diffuzivliyidir (bizim şəraitdə orta hesabla). halda, şüşə və su Diffuziya dərəcəsi\(D\ təxminən 2\qat {10}^{-7}\) m2/s). temperaturun dəyişməsi gözlənilə bilər ki, bu ani temperatur artımı təcrübənin müddətini qısaldır, həm də temperatur effektlərinin hər hansı dinamik öyrənilməsi üçün dəqiq vaxt təyin etməyə imkan verir.
Təklif etdiyimiz metod hər hansı bir işığı udan substrata (məsələn, İTO örtüyü olan kommersiya nümunələri) şamil edilir. Bununla belə, qızıl nanohissəciklər infraqırmızı diapazonda yüksək udma və görünən diapazonda aşağı udma təmin edə bilir, onların sonuncu xüsusiyyətləri görünən diapazonda, xüsusən də flüoresandan istifadə edərkən effektiv optik müşahidə üçün maraq doğurur. Bundan əlavə, qızıl biouyğundur, kimyəvi cəhətdən inertdir, optik sıxlığı 530 nm-dən yaxın infraqırmızıya qədər tənzimləmək olar və nümunənin hazırlanması sadə və qənaətcildir29.
Transvers grating wavefront mikroskopiyası (CGM) yalnız mikromiqyasda temperaturun xəritələşdirilməsinə deyil, həm də biokütlənin monitorinqinə imkan verir ki, bu da onu LA-HTM ilə birlikdə xüsusilə faydalı edir (lazım deyilsə). Son onillikdə, xüsusilə bioimaging sahəsində digər temperatur mikroskopiya üsulları hazırlanmışdır və onların əksəriyyəti temperatura həssas floresan zondların istifadəsini tələb edir54,55. Bununla belə, bu üsullar tənqid edilmişdir və bəzi hesabatlar, ehtimal ki, flüoresansiyanın temperaturdan başqa bir çox faktordan asılı olması səbəbindən hüceyrələr daxilində qeyri-real temperatur dəyişikliklərini ölçmüşdür. Bundan əlavə, floresan zondların əksəriyyəti yüksək temperaturda qeyri-sabitdir. Buna görə QPM və xüsusilə CGM optik mikroskopiyadan istifadə edərək yüksək temperaturda həyatı öyrənmək üçün ideal temperatur mikroskopiya texnikasını təmsil edir.
80°C-də optimal şəkildə yaşayan S.shibatae üzərində aparılan tədqiqatlar göstərir ki, LA-HTM sadə termofilləri deyil, hipertermofilləri də öyrənmək üçün tətbiq oluna bilər. Prinsipcə, LA-HTM-dən istifadə etməklə əldə edilə bilən temperatur diapazonunda heç bir məhdudiyyət yoxdur və hətta 100°C-dən yuxarı temperaturlara atmosfer təzyiqində hidrotermal kimya tətbiqlərində 38-dən ibarət qrupumuz tərəfindən göstərildiyi kimi, qaynamadan əldə edilə bilər. təzyiq A. Eyni şəkildə qızıl nanohissəciklərin 40 qızdırılması üçün lazerdən istifadə edilir. Beləliklə, LA-HTM standart şəraitdə (yəni ətraf mühitin gərginliyi altında) standart yüksək ayırdetməli optik mikroskopiya ilə misli görünməmiş hipertermofilləri müşahidə etmək üçün istifadə olunmaq potensialına malikdir.
Bütün təcrübələr Köhler işıqlandırması (LED ilə, M625L3, Thorlabs, 700 mVt), əl ilə xy hərəkəti olan nümunə tutucusu, məqsədləri (Olympus, 60x, 0.7 NA, hava, LUCPlanFLN60X və ya 60x, NA 1il) daxil olmaqla, evdə hazırlanmış mikroskopdan istifadə etməklə həyata keçirilib. , UPLFLN60XOI), intensivlik və dalğa cəbhəsi təsvirini təmin etmək üçün CGM kamera (QLSI çarpaz ızgarası, 39 µm addım, Andor Zyla kamera sensorundan 0,87 mm) və qeyd etmək üçün sCMOS kamera (ORCA Flash 4.0 V3, 16-bit rejim , Hamamatsu-dan) Şəkil 5-də göstərilən məlumatlar (bakterial üzgüçülük). Dikroik şüa ayırıcı 749 nm BrightLine kənarıdır (Semrock, FF749-SDi01). Kameranın ön hissəsindəki filtr 694 qısa keçid filtridir (FF02-694/SP-25, Semrock). Titan sapfir lazer (Lazer Verdi G10, 532 nm, 10 Vt, pompalanan sunami lazer boşluğu, Şəkil 2-5-də Spectra-Fizika, daha sonra Millenia lazeri ilə əvəz olundu, Spectraphysics 10 W, pompalanan Mira lazer boşluğu, Şəkil 2 üçün Koherent, -5). 6 və 7) qızıl nanohissəciklərin plazmon rezonans spektrinə uyğun gələn \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm dalğa uzunluğuna təyin edilmişdir. Məkan işıq modulatorları (1920 × 1152 piksel) Meadowlark Optics-dən alınmışdır.
Çarpaz ızgara dalğa cəbhəsi mikroskopiyası (CGM) adi kameranın sensorundan bir millimetr məsafədə iki ölçülü difraksiya ızgarasını (həmçinin çarpaz barmaqlıq kimi tanınır) birləşdirməyə əsaslanan optik mikroskopiya texnikasıdır. Bu işdə istifadə etdiyimiz CGM-nin ən çox yayılmış nümunəsi dörd dalğa uzunluğunda eninə sürüşmə interferometri (QLSI) adlanır, burada çarpaz ızgara Primot və digərləri tərəfindən təqdim edilmiş və patentləşdirilmiş intensivlik/faza dama taxtası nümunəsindən ibarətdir. 200034. Şaquli və üfüqi barmaqlıq xətləri sensorda toruşəbənzər kölgələr yaradır ki, onların təhrifi real vaxt rejimində rəqəmsal şəkildə emal edilə bilər ki, bu da hadisə işığının optik dalğa cəbhəsinin təhrifini (və ya ekvivalent faza profilini) əldə edə bilər. Mikroskopda istifadə edildikdə, CGM kamerası optik dərinlik (OT) olaraq da bilinən təsvir edilən obyektin optik yol fərqini nanometrlər sırasına uyğun həssaslıqla göstərə bilər36. İstənilən CGM ölçülməsində, optik komponentlər və ya şüalardakı hər hansı qüsurları aradan qaldırmaq üçün ilkin istinad OT təsviri götürülməli və hər hansı sonrakı şəkillərdən çıxılmalıdır.
İstinadda təsvir olunduğu kimi, temperatur mikroskopiyası CGM kamerasından istifadə etməklə aparılmışdır. 32. Qısacası, mayenin qızdırılması onun sındırma indeksini dəyişdirərək, gələn şüanı təhrif edən termal linza effekti yaradır. Bu dalğa cəbhəsi təhrifi CGM tərəfindən ölçülür və maye mühitdə üç ölçülü temperatur paylanması əldə etmək üçün dekonvolyutsiya alqoritmi ilə işlənir. Əgər qızıl nanohissəciklər nümunə boyu bərabər paylanırsa, daha yaxşı təsvirlər yaratmaq üçün bakteriya olmayan ərazilərdə temperatur xəritələri aparıla bilər ki, biz bəzən bunu edirik. İstinad CGM təsviri qızdırılmadan (lazer söndürüldükdə) əldə edildi və sonra lazer yandırılmış şəkildə təsvirin eyni yerində çəkildi.
Quru kütlənin ölçülməsi temperaturun görüntülənməsi üçün istifadə edilən eyni CGM kamerasından istifadə etməklə həyata keçirilir. CGM istinad şəkilləri, bakteriyaların mövcudluğuna görə OT-də hər hansı bir qeyri-bərabərliyin orta hesablanması vasitəsi kimi ekspozisiya zamanı nümunəni x və y-də sürətlə hərəkət etdirməklə əldə edilmişdir. Bakteriyaların OT görüntülərindən onların biokütləsi ref.-də təsvir edilən prosedura əməl edərək, Matlab-ın evdə hazırlanmış seqmentasiya alqoritmi (bax: “Rəqəm kodu” alt bölməsi) ilə seçilmiş ərazilər üzərində təsvirlər ansamblından istifadə etməklə əldə edilmişdir. 48. Bir sözlə, \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} münasibətindən istifadə edirik. } x{{\mbox{d}}}y\), burada \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) optik dərinlik şəklidir, \(m\) quru çəki və \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) sabitdir. Canlı hüceyrələr üçün tipik sabit olan \({{{\rm{\alpha))))))=0,18\) µm3/pg seçdik.
25 mm diametrli və 150 µm qalınlığında qızıl nanohissəciklərlə örtülmüş örtük slipi qızıl nanohissəcikləri yuxarı baxaraq AttofluorTM kamerasına (Thermofisher) yerləşdirildi. Geobacillus stearothermophilus eksperimentlərin hər günündən əvvəl LB mühitində (200 rpm, 60°C) bir gecədə əvvəlcədən kulturasiya edilmişdir. Optik sıxlığı (OD) 0,3-dən 0,5-ə qədər olan G. stearothermophilus suspenziyasının 5 µl damcısı qızıl nanohissəciklərlə örtülmüş slip üzərinə qoyuldu. Sonra, damcıya mərkəzdə diametri 5 mm olan 18 mm diametrli yuvarlaq örtük slipi salındı və çuxurun mərkəzinə təkrar-təkrar eyni optik sıxlığa malik 5 μl bakteriya süspansiyonu tətbiq edildi. Qapaqlardakı quyular ref.-də təsvir olunan prosedura uyğun olaraq hazırlanmışdır. 45 (əlavə məlumat üçün Əlavə Məlumata baxın). Sonra maye təbəqənin qurumasının qarşısını almaq üçün örtüyə 1 ml LB mühiti əlavə edin. Sonuncu örtük inkubasiya zamanı mühitin buxarlanmasının qarşısını almaq üçün Attofluor™ kamerasının qapalı qapağının üzərinə qoyulur. Cücərmə təcrübələri üçün biz adi təcrübələrdən sonra bəzən üst örtüyü örtən sporlardan istifadə etdik. Sulfolobus shibatae əldə etmək üçün oxşar üsuldan istifadə edilmişdir. Thiobacillus serrata-nın ilkin becərilməsi üç gün (200 rpm, 75°C) 182 (DSMZ) mühitində aparılmışdır.
Qızıl nanohissəciklərin nümunələri misel bloklu kopolimer litoqrafiya üsulu ilə hazırlanmışdır. Bu proses bölmədə ətraflı təsvir edilmişdir. 60. Qısaca, qızıl ionlarını əhatə edən misellər toluolda HAuCl4 ilə sopolimerin qarışdırılması ilə sintez edilmişdir. Sonra təmizlənmiş örtüklər məhlula batırılmış və qızıl toxumları əldə etmək üçün azaldıcı maddənin iştirakı ilə UV şüalanması ilə müalicə edilmişdir. Nəhayət, qızıl toxumları 16 dəqiqə ərzində KAuCl4 və etanolamin sulu məhlulu ilə örtülmə ilə təmasda saxlanılaraq yetişdirildi, bu da yaxın infraqırmızıda qeyri-sferik qızıl nanohissəciklərin kvazi dövri və çox vahid düzülüşü ilə nəticələndi.
İnterferoqramları OT şəkillərinə çevirmək üçün linkdə ətraflı göstərildiyi kimi evdə hazırlanmış alqoritmdən istifadə etdik. 33 və aşağıdakı ictimai depoda Matlab paketi kimi mövcuddur: https://github.com/baffou/CGMprocess. Paket qeydə alınmış interferoqramlar (istinad şəkilləri daxil olmaqla) və kamera massivi məsafələri əsasında intensivliyi və OT şəkillərini hesablaya bilər.
Verilmiş temperatur profilini əldə etmək üçün SLM-ə tətbiq olunan faza modelini hesablamaq üçün biz aşağıdakı ictimai depoda mövcud olan əvvəllər işlənmiş ev alqoritmindən39,42 istifadə etdik: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Giriş rəqəmsal və ya monoxrom bmp təsviri vasitəsilə təyin edilə bilən istənilən temperatur sahəsidir.
Hüceyrələri bölmək və onların quru çəkisini ölçmək üçün biz aşağıdakı ictimai depoda dərc edilmiş Matlab alqoritmimizdən istifadə etdik: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Hər bir təsvirdə istifadəçi maraq doğuran bakteriya və ya mCFU üzərinə klikləməli, çubuq həssaslığını tənzimləməli və seçimi təsdiqləməlidir.
Tədqiqat dizaynı haqqında daha çox məlumat üçün bu məqalə ilə əlaqəli Təbiət Tədqiqat Hesabatının xülasəsinə baxın.
Bu tədqiqatın nəticələrini dəstəkləyən məlumatlar əsaslı sorğu əsasında müvafiq müəlliflərdən əldə edilə bilər.
Bu araşdırmada istifadə olunan mənbə kodu Metodlar bölməsində ətraflı təsvir edilmişdir və sazlama versiyaları https://github.com/baffou/ saytından aşağıdakı depolarda endirilə bilər: SLM_temperatureShaping, CGMprocess və CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Termofillərə və onların geniş spektrli tətbiqlərinə dair fikir. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Termofillərə və onların geniş spektrli tətbiqlərinə dair fikir.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. and Sharma, AK Termofillərin icmalı və onların geniş tətbiqi. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. və Sharma AK. Termofillər haqqında dərin anlayış və geniş tətbiqlər.3 Biotexnologiya 6, 81 (2016).
Göndərmə vaxtı: 26 sentyabr 2022-ci il