Alzheimer xəstəliyində (AD) onun çoxsaylı əsas patofiziologiyasını əks etdirən zülal biomarkerləri yoxdur ki, bu da diaqnoz və müalicənin gedişatına mane olur. Burada AD patofiziologiyasının geniş spektrini təmsil edən serebrospinal mayenin (CSF) biomarkerlərini müəyyən etmək üçün hərtərəfli proteomikadan istifadə edirik. Multipleks kütlə spektrometriyası AD CSF və beyində müvafiq olaraq təxminən 3500 və təxminən 12000 zülal müəyyən etdi. Beyin proteomunun şəbəkə analizi 44 biomüxtəliflik modulunu həll etdi, onlardan 15-i onurğa beyni mayesinin proteomu ilə üst-üstə düşür. Bu üst-üstə düşən modullardakı CSF AD markerləri müxtəlif patofizyoloji prosesləri təmsil edən beş protein qrupuna qatlanır. AD beynindəki sinapslar və metabolitlər azalır, lakin CSF artır, beyin və CSF-də glial zəngin miyelinasiya və immun qrupları artır. Panel dəyişikliklərinin tutarlılığı və xəstəlik spesifikliyi 500-dən çox əlavə CSF nümunəsində təsdiq edilmişdir. Bu qruplar həmçinin asemptomatik AD-də bioloji alt qrupları müəyyən etdilər. Ümumilikdə, bu nəticələr AD-də klinik tətbiqlər üçün veb əsaslı biomarker alətlərinə doğru perspektivli bir addımdır.
Alzheimer xəstəliyi (AD) bütün dünyada neyrodegenerativ demansın ən çox yayılmış səbəbidir və sinaptik ötürülmə, glial-vasitəçi toxunulmazlıq və mitoxondrial metabolizm də daxil olmaqla, bioloji sistem disfunksiyalarının geniş spektri ilə xarakterizə olunur (1-3). Bununla belə, onun müəyyən edilmiş protein biomarkerləri hələ də amiloid və tau zülalının aşkarlanmasına diqqət yetirir və buna görə də bu müxtəlif patofiziologiyanı əks etdirə bilmir. Serebrospinal mayedə (CSF) ən etibarlı şəkildə ölçülən bu “əsas” protein biomarkerlərinə (i) kortikal amiloid lövhələrinin əmələ gəlməsini əks etdirən amiloid beta peptid 1-42 (Aβ1-42); (ii) total tau, akson degenerasiyasının əlaməti; (iii) fosfo-tau (p-tau), patoloji tau hiperfosforilasiyasının nümayəndəsi (4-7). Bu serebrospinal mayenin biomarkerləri bizim “işarələnmiş” AD zülal xəstəliklərinin (4-7) aşkar edilməsini xeyli asanlaşdırsa da, onlar xəstəliyin arxasında duran kompleks biologiyanın yalnız kiçik bir hissəsini təmsil edir.
AD biomarkerlərinin patofizioloji müxtəlifliyinin olmaması bir çox problemlərə gətirib çıxardı, o cümlədən (i) AD xəstələrinin bioloji heterojenliyini müəyyən etmək və kəmiyyətcə təyin etmək mümkünsüzlüyü, (ii) xəstəliyin şiddətinin və gedişatının, xüsusən də preklinik mərhələdə qeyri-kafi ölçülməsi, Və ( iii) nevroloji pozğunluğun bütün aspektlərini tamamilə həll edə bilməyən terapevtik dərmanların inkişafı. AD-ni əlaqəli xəstəliklərdən təsvir etmək üçün əlamətdar patologiyaya etibar etməyimiz bu problemləri daha da gücləndirir. Getdikcə daha çox sübut göstərir ki, demanslı yaşlı insanların əksəriyyətində koqnitiv geriləmənin birdən çox patoloji xüsusiyyəti var (8). AD patologiyası olan şəxslərin 90% və ya daha çoxunda damar xəstəlikləri, TDP-43 daxilolmaları və ya digər degenerativ xəstəliklər var (9). Patoloji üst-üstə düşmənin bu yüksək nisbətləri demans üçün mövcud diaqnostik çərçivəmizi pozdu və xəstəliyin daha əhatəli patofizyoloji tərifinə ehtiyac var.
Müxtəlif AD biomarkerlərinə təcili ehtiyacı nəzərə alaraq, sahə biomarkerləri aşkar etmək üçün ümumi sistemə əsaslanan “omiks” metodunu getdikcə daha çox qəbul edir. Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance 2014-cü ildə fəaliyyətə başlayıb və proqramın ön sıralarındadır. Milli Sağlamlıq İnstitutları, akademiya və sənaye tərəfindən həyata keçirilən bu multidissiplinar səy AD-nin patofiziologiyasını daha yaxşı müəyyən etmək və biomüxtəlifliyin diaqnostik təhlili və müalicə strategiyalarını inkişaf etdirmək üçün sistem əsaslı strategiyalardan istifadə etmək məqsədi daşıyır (10). Bu layihənin bir hissəsi olaraq, şəbəkə proteomikası AD-də sistem əsaslı biomarkerlərin inkişafı üçün perspektivli bir vasitəyə çevrildi. Bu qərəzsiz məlumatlara əsaslanan yanaşma, kompleks proteomik məlumat dəstlərini xüsusi hüceyrə növləri, orqanellər və bioloji funksiyalarla əlaqəli olan birgə ifadə olunan zülalların qruplarına və ya “modullarına” təşkil edir (11-13). AD beynində demək olar ki, 12 məlumatla zəngin şəbəkə proteomikası tədqiqatları aparılmışdır (13-23). Ümumiyyətlə, bu təhlillər göstərir ki, AD beyin şəbəkəsi proteomu müstəqil kohortlarda və çoxlu kortikal bölgələrdə yüksək dərəcədə qorunan modul təşkilatı saxlayır. Bundan əlavə, bu modulların bəziləri çoxlu xəstəliklərin patofiziologiyasını əks etdirən məlumat dəstləri arasında AD ilə əlaqəli bolluqda təkrarlana bilən dəyişiklikləri göstərir. Kollektiv olaraq, bu tapıntılar AD-də sistem əsaslı biomarker kimi beyin şəbəkəsi proteomunun kəşfi üçün perspektivli lövbər nöqtəsini nümayiş etdirir.
AD beyin şəbəkəsi proteomunu klinik cəhətdən faydalı sistem əsaslı biomarkerlərə çevirmək üçün biz beyindən əldə edilən şəbəkəni AD CSF-nin proteomik analizi ilə birləşdirdik. Bu inteqrasiya olunmuş yanaşma sinapslar, qan damarları, miyelinləşmə, iltihab və metabolik yolların disfunksiyaları daxil olmaqla, beyinə əsaslanan geniş spektrli patofiziologiya ilə əlaqəli olan beş perspektivli CSF biomarker dəstinin müəyyən edilməsinə səbəb oldu. Biz bu biomarker panellərini müxtəlif neyrodegenerativ xəstəliklərdən 500-dən çox CSF nümunəsi də daxil olmaqla çoxsaylı təkrarlama analizləri vasitəsilə uğurla təsdiq etdik. Bu təsdiqləmə təhlillərinə asemptomatik AD (AsymAD) olan xəstələrin CSF-də qrup hədəflərinin araşdırılması və ya normal idrak mühitində anormal amiloid yığılmasının sübutunun göstərilməsi daxildir. Bu təhlillər AsymAD populyasiyasında əhəmiyyətli bioloji heterojenliyi vurğulayır və xəstəliyin ən erkən mərhələlərində fərdləri alt tipləşdirə bilən panel markerlərini müəyyən edir. Ümumilikdə, bu nəticələr AD-nin üzləşdiyi bir çox klinik problemləri uğurla həll edə bilən çoxsaylı sistemlərə əsaslanan protein biomarker alətlərinin inkişafında əsas addımdır.
Bu tədqiqatın əsas məqsədi AD-yə səbəb olan müxtəlif beyin əsaslı patofiziologiyanı əks etdirən yeni serebrospinal maye biomarkerlərini müəyyən etməkdir. Şəkil S1 tədqiqat metodologiyamızı təsvir edir, bura (i) beyinlə əlaqəli çoxsaylı CSF xəstəliyinin biomarkerlərini müəyyən etmək üçün AD CSF və şəbəkə beyin proteomunun ilkin nəticələrinə əsaslanan hərtərəfli təhlil və (ii) sonrakı replikasiya Bu biomarkerlər bir neçə müstəqil serebrospinaldadır. maye kohortlar. Kəşf yönümlü tədqiqat Emory Goizueta Alzheimer Xəstəlikləri Araşdırma Mərkəzində (ADRC) 20 koqnitiv normal fərddə və 20 AD xəstəsində CSF-nin diferensial ifadəsinin təhlili ilə başladı. AD diaqnozu serebrospinal mayedə aşağı Aβ1-42 və ümumi tau və p-tau səviyyələrinin yüksəlməsi [Orta Montreal Koqnitiv Qiymətləndirmə (MoCA), 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA) mövcudluğunda əhəmiyyətli koqnitiv pozğunluq kimi müəyyən edilir. )]] (Cədvəl S1A). Nəzarətdə (ortalama MoCA, 26.7 ± 2.2) CSF biomarkerlərinin normal səviyyələri var idi.
İnsan CSF protein bolluğunun dinamik diapazonu ilə xarakterizə olunur, burada albumin və digər çox zəngin zülallar maraq doğuran zülalların aşkarlanmasına mane ola bilər (24). Zülal kəşfinin dərinliyini artırmaq üçün biz kütləvi spektrometriya (MS) analizindən əvvəl hər bir CSF nümunəsindən ilk 14 yüksək bol proteini çıxardıq (24). Ümumilikdə MS tərəfindən 39,805 peptid müəyyən edildi, onlar 40 nümunədə 3691 proteomla xəritələndi. Protein miqdarının təyini çoxlu tandem kütlə etiketi (TMT) etiketlənməsi ilə həyata keçirilir (18, 25). Çatışmayan məlumatları həll etmək üçün biz yalnız nümunələrin ən azı 50% -ində kəmiyyəti müəyyən edilmiş zülalları daxil etdik və nəticədə 2875 proteomun miqdarını təyin etdik. Ümumi zülal bolluğu səviyyələrində əhəmiyyətli fərqə görə, bir nəzarət nümunəsi statistik olaraq kənar göstərici hesab edildi (13) və sonrakı təhlilə daxil edilmədi. Qalan 39 nümunənin bolluq dəyərləri yaşa, cinsə və partiya kovariasiyasına (13-15, 17, 18, 20, 26) uyğun olaraq düzəldildi.
Reqressiya məlumat dəstində diferensial ifadəni qiymətləndirmək üçün statistik t-test analizindən istifadə edərək, bu analiz nəzarət və AD halları arasında bolluq səviyyələri əhəmiyyətli dərəcədə dəyişmiş (P <0.05) zülalları müəyyən etdi (Cədvəl S2A). Şəkil 1A-da göstərildiyi kimi, AD-də cəmi 225 zülalın bolluğu əhəmiyyətli dərəcədə azaldı və 303 zülalın bolluğu əhəmiyyətli dərəcədə artdı. Bu diferensial şəkildə ifadə olunan zülallara əvvəllər müəyyən edilmiş bir neçə serebrospinal mayenin AD markerləri daxildir, məsələn, mikrotubulla əlaqəli protein tau (MAPT; P = 3.52 × 10−8), neyrofilament (NEFL; P = 6.56 × 10−3), böyümə ilə əlaqəli Protein 43 (GAP43; P = 1.46 × 10−5), Yağ Turşusu Bağlayıcı Zülal 3 (FABP3; P = 2.00 × 10−5), Xitinaza 3 1 kimi (CHI3L1; P = 4.44 × 10−6), Sinir Qranulin (NRGN; P = 3.43 × 10−4) və VGF sinir böyümə faktoru (VGF; P = 4.83 × 10−3) (4-6). Bununla belə, biz GDP dissosiasiya inhibitoru 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) və SPARC ilə əlaqəli modul kalsium bağlaması 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9) kimi digər çox vacib hədəfləri də müəyyən etdik. 225 əhəmiyyətli dərəcədə azalmış zülalın Gen Ontologiyası (GO) analizi steroid mübadiləsi, qan laxtalanması və hormon fəaliyyəti kimi bədən maye prosesləri ilə sıx əlaqəni aşkar etdi (Şəkil 1B və Cədvəl S2B). Bunun əksinə olaraq, 303-ün əhəmiyyətli dərəcədə artan proteini hüceyrə quruluşu və enerji mübadiləsi ilə sıx bağlıdır.
(A) Vulkan planı t-testi ilə əldə edilən -log10 statistik P dəyərinə (y oxu) nisbətən log2 qat dəyişikliyini (x oxu) göstərir, bu da nəzarət (CT) ilə diferensial ifadəni aşkar etmək üçün istifadə olunur. Bütün zülalların CSF proteomunun AD halları. AD-də səviyyələri əhəmiyyətli dərəcədə azalmış zülallar (P <0,05) mavi, xəstəlikdə əhəmiyyətli dərəcədə artan zülallar isə qırmızı rənglə göstərilir. Seçilmiş zülal etiketlənir. (B) Zülalla əlaqəli ən yaxşı GO terminləri AD-də əhəmiyyətli dərəcədə azaldılır (mavi) və artır (qırmızı). Bioloji proseslər, molekulyar funksiyalar və hüceyrə komponentləri sahələrində ən yüksək z-balı olan üç GO terminini göstərir. (C) MS CSF nümunəsində MAPT səviyyəsini ölçdü (solda) və onun nümunə ELISA tau səviyyəsi ilə əlaqəsi (sağda). Müvafiq P dəyəri ilə Pearson korrelyasiya əmsalı göstərilir. Bir AD hadisəsi üçün ELISA məlumatlarının olmaması səbəbindən bu rəqəmlərə təhlil edilən 39 hadisədən 38-i üçün dəyərlər daxildir. (D) Nəzarətdə olan klaster analizi (P <0.0001, Benjamini-Hochberg (BH) düzəliş edilmiş P <0.01) nəzarət və AD CSF məlumat dəstində 65 ən əhəmiyyətli şəkildə dəyişdirilmiş zülaldan istifadə edərək nümunələr tapdı. Standartlaşdırmaq, normallaşdırmaq.
MAPT-nin proteomik səviyyəsi müstəqil olaraq ölçülmüş ELISA tau səviyyəsi ilə sıx bağlıdır (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; Şəkil 1C), MS ölçməmizin etibarlılığını dəstəkləyir. Amiloid prekursor zülalı (APP) səviyyəsində tripsin həzm edildikdən sonra Aβ1-40 və Aβ1-42-nin C-terminusuna uyğunlaşdırılmış izoforma spesifik peptidlər səmərəli şəkildə ionlaşdırıla bilməz (27, 28). Buna görə də, müəyyən etdiyimiz APP peptidlərinin ELISA Aβ1-42 səviyyələri ilə heç bir əlaqəsi yoxdur. Hər bir halın diferensial ifadəsini qiymətləndirmək üçün biz nümunələrin nəzarət edilən klaster analizini yerinə yetirmək üçün P <0,0001 [yalançı kəşf dərəcəsi (FDR) düzəldilmiş P <0,01] olan diferensial şəkildə ifadə edilmiş zülallardan istifadə etdik (Cədvəl S2A). Şəkil 1D-də göstərildiyi kimi, bu 65 yüksək əhəmiyyətli zülal nəzarətə bənzər xüsusiyyətlərə malik bir AD halı istisna olmaqla, nümunələri xəstəlik vəziyyətinə uyğun olaraq düzgün qruplaşdıra bilir. Bu 65 zülaldan 63-ü AD-də artdı, yalnız ikisi (CD74 və ISLR) azaldı. Ümumilikdə, bu serebrospinal maye analizləri AD-də xəstəliyin biomarkerləri kimi xidmət edə biləcək yüzlərlə zülal müəyyən etdi.
Sonra AD beyin proteomunun müstəqil şəbəkə analizini həyata keçirdik. Bu kəşfin beyin kohortuna nəzarətdən olan dorsolateral prefrontal korteks (DLPFC) (n = 10), Parkinson xəstəliyi (PD; n = 10), qarışıq AD/PD (n = 10) və AD (n = 10) halları daxildir. ) Nümunə. Emery Goizueta ADRC. Bu 40 halın demoqrafik göstəriciləri daha əvvəl təsvir edilmişdir (25) və Cədvəl S1B-də ümumiləşdirilmişdir. Bu 40 beyin toxumasını və 27 hadisənin replikasiya kohortunu təhlil etmək üçün TMT-MS-dən istifadə etdik. Ümumilikdə, bu iki beyin məlumat dəsti 227,121 unikal peptid istehsal etdi və bu peptidlər 12,943 proteomla əlaqələndirildi (25). Yalnız ən azı 50% hallarda kəmiyyəti müəyyən edilmiş zülallar sonrakı araşdırmalara daxil edilmişdir. Son kəşf məlumat dəstində 8817 kəmiyyətləşdirilmiş zülal var. Yaş, cins və post-mortem interval (PMI) əsasında protein bolluğu səviyyələrini tənzimləyin. Reqressiyadan sonra verilənlər toplusunun diferensial ifadə təhlili göstərdi ki, iki və ya daha çox xəstəlik kohortunda >2000 protein səviyyəsi əhəmiyyətli dərəcədə dəyişib [P <0.05, dispersiya təhlili (ANOVA)]. Daha sonra biz diferensial şəkildə ifadə olunan zülallara və AD/nəzarət və/və ya AD/PD müqayisələrində P <0,0001 (Şəkil S2, A və B, Cədvəl S2C) əsasında nəzarət edilən klaster analizini həyata keçirdik. Bu 165 yüksək dərəcədə dəyişdirilmiş zülallar nəzarət və PD nümunələrindən AD patologiyası olan halları aydın şəkildə təsvir edir və bütün proteomda güclü AD-yə xas dəyişiklikləri təsdiqləyir.
Daha sonra kəşf edilmiş beyin proteomunda şəbəkə analizini həyata keçirmək üçün Weighted Gen Co-Expression Network Analysis (WGCNA) adlı alqoritmdən istifadə etdik ki, bu da məlumat dəstini oxşar ifadə nümunələri ilə zülal modullarına təşkil edir (11-13). Təhlil ən böyükdən (M1, n = 1821 zülal) ən kiçikə (M44, n = 34 zülal) qədər çeşidlənmiş və nömrələnmiş 44 modul (M) birgə ifadə edilmiş zülalları müəyyən etdi (Şəkil 2A və Cədvəl S2D) ). Yuxarıda qeyd edildiyi kimi (13) Hər bir modulun təmsilçi ifadə profilini və ya xarakterik zülalını hesablayın və onu xəstəlik vəziyyəti və AD patologiyası ilə əlaqələndirin, yəni Alzheimer Xəstəlikləri Qeydiyyatı (CERAD) və Braak Skorunun ittifaqını qurun (Şəkil 2B). Ümumiyyətlə, 17 modul AD nevropatologiyası ilə əhəmiyyətli dərəcədə əlaqəli idi (P <0.05). Xəstəliklə əlaqəli bu modulların çoxu hüceyrə tipinə xas markerlərlə də zəngindir (Şəkil 2B). Yuxarıda qeyd edildiyi kimi (13), hüceyrə tipinin zənginləşdirilməsi modulun üst-üstə düşməsini və hüceyrə tipinə xas genlərin istinad siyahısını təhlil etməklə müəyyən edilir. Bu genlər təcrid olunmuş siçan neyronlarında, endotel və glial hüceyrələrdə dərc edilmiş məlumatlardan əldə edilir. RNT ardıcıllığı (RNT-seq) təcrübəsi (29).
(A) Beyin proteomunun WGCNA-sını kəşf edin. (B) CERAD (Aβ lövhə) və Braak (tau dolaşıqları) xalları da daxil olmaqla, AD nevropatoloji xüsusiyyətləri (yuxarı) ilə modul imza zülalının (modul protein ifadəsinin ilk əsas komponenti) iki çəkili orta korrelyasiya (BiCor) təhlili. Müsbət (qırmızı) və mənfi (mavi) korrelyasiya intensivliyi iki rəngli istilik xəritəsi ilə göstərilir və ulduzlar statistik əhəmiyyəti göstərir (P <0.05). Hər bir zülal modulunun hüceyrə tipli assosiasiyasını qiymətləndirmək üçün Hipergeometrik Fişerin Dəqiq Testindən (FET) (aşağıda) istifadə edin. Qırmızı kölgənin intensivliyi hüceyrə növünün zənginləşmə dərəcəsini, ulduz işarəsi isə statistik əhəmiyyəti göstərir (P <0,05). FET-dən alınan P dəyərini düzəltmək üçün BH metodundan istifadə edin. (C) modul zülalların GO analizi. Hər bir modul və ya əlaqəli modul qrupu üçün ən yaxından əlaqəli bioloji proseslər göstərilir. oliqo, oliqodendrosit.
Beş yaxından əlaqəli astrosit və mikroglia ilə zəngin modul dəsti (M30, M29, M18, M24 və M5) AD nevropatologiyası ilə güclü müsbət korrelyasiya göstərdi (Şəkil 2B). Ontoloji təhlil bu glial modulları hüceyrə böyüməsi, yayılması və toxunulmazlığı ilə əlaqələndirir (Şəkil 2C və Cədvəl S2E). İki əlavə glial modul, M8 və M22 də xəstəlikdə güclü şəkildə tənzimlənir. M8 anadangəlmə immun cavabında əsas rol oynayan siqnal şəlaləsi olan Toll-bənzər reseptor yolu ilə çox bağlıdır (30). Eyni zamanda, M22 post-translational modifikasiya ilə sıx bağlıdır. Oliqodendrositlərlə zəngin olan M2, AD patologiyası ilə güclü müsbət korrelyasiya və nukleozidlərin sintezi və DNT replikasiyası ilə ontoloji əlaqə göstərir, bu da xəstəliklərdə hüceyrə proliferasiyasının güclənməsini göstərir. Ümumiyyətlə, bu tapıntılar AD şəbəkə proteomunda əvvəllər müşahidə etdiyimiz glial modulların yüksəlməsini dəstəkləyir (13, 17). Hal-hazırda şəbəkədə AD ilə əlaqəli bir çox glial modulların AD-də yüksəlmiş xəstəliyin spesifikliyini vurğulayaraq, nəzarət və PD hallarında daha aşağı ifadə səviyyələri göstərdiyi aşkar edilmişdir (Şəkil S2C).
Şəbəkə proteomumuzdakı yalnız dörd modul (M1, M3, M10 və M32) AD patologiyası ilə güclü mənfi əlaqədədir (P <0.05) (Şəkil 2, B və C). Həm M1, həm də M3 neyron markerlərlə zəngindir. M1 sinaptik siqnallarla, M3 isə mitoxondrial funksiya ilə sıx bağlıdır. M10 və M32 üçün hüceyrə növünün zənginləşdirilməsinə dair heç bir sübut yoxdur. M32, M3 və hüceyrə metabolizması arasındakı əlaqəni əks etdirir, M10 isə hüceyrə böyüməsi və mikrotubul funksiyası ilə yüksək dərəcədə əlaqəlidir. AD ilə müqayisədə, bütün dörd modul nəzarət və PD-də artır və onlara xəstəliyə xas AD dəyişiklikləri verir (Şəkil S2C). Ümumiyyətlə, bu nəticələr AD-də əvvəllər müşahidə etdiyimiz neyronla zəngin modulların bolluğunun azaldığını dəstəkləyir (13, 17). Xülasə, kəşf etdiyimiz beyin proteomunun şəbəkə analizi əvvəlki tapıntılarımıza uyğun olaraq AD üçün xüsusi olaraq dəyişdirilmiş modullar istehsal etdi.
AD erkən asimptomatik mərhələ (AsymAD) ilə xarakterizə olunur, burada fərdlər klinik koqnitiv azalma olmadan amiloid yığılmasını nümayiş etdirir (5, 31). Bu asimptomatik mərhələ erkən aşkarlanma və müdaxilə üçün kritik bir pəncərədir. Biz əvvəllər müstəqil məlumat dəstləri arasında AsymAD və AD beyin şəbəkəsi proteomunun güclü modul saxlanmasını nümayiş etdirmişik (13, 17). Hazırda kəşf etdiyimiz beyin şəbəkəsinin bu əvvəlki tapıntılara uyğun olmasını təmin etmək üçün biz 27 DLPFC təşkilatından təkrarlanan məlumat dəstində 44 modulun qorunub saxlanmasını təhlil etdik. Bu təşkilatlara nəzarət (n = 10), AsymAD (n = 8) və AD (n = 9) halları daxildir. Nəzarət və AD nümunələri kəşf beyin kohortumuzun təhlilinə daxil edildi (Cədvəl S1B), AsymAD halları isə yalnız replikasiya kohortunda unikal idi. Bu AsymAD halları da Emory Goizueta ADRC beyin bankından gəldi. Ölüm zamanı idrakın normal olmasına baxmayaraq, amiloid səviyyələri anormal dərəcədə yüksək idi (orta CERAD, 2,8 ± 0,5) (Cədvəl S1B).
Bu 27 beyin toxumasının TMT-MS analizi 11.244 proteomun miqdarının müəyyən edilməsi ilə nəticələndi. Bu son hesaba yalnız nümunələrin ən azı 50%-də ölçülən zülallar daxildir. Bu təkrarlanan məlumat dəstində kəşf beyin analizimizdə aşkar edilmiş 8817 zülaldan 8638-i (98,0%) var və nəzarət və AD kohortları arasında 3000-ə yaxın əhəmiyyətli dərəcədə dəyişmiş zülal var (P <0,05, dispersiya təhlili üçün Tukeynin qoşalaşmış t testindən sonra) ( Cədvəl S2F). Bu diferensial şəkildə ifadə edilən zülallar arasında 910 AD və beyin proteomuna nəzarət halları arasında əhəmiyyətli səviyyə dəyişiklikləri də göstərdi (P <0.05, ANOVA Tukey qoşalaşmış t-testindən sonra). Qeyd etmək lazımdır ki, bu 910 markerlər proteomlar arasında dəyişiklik istiqamətində olduqca uyğundur (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (Şəkil S3A). Artan zülallar arasında məlumat dəstləri arasında ən ardıcıl dəyişikliklərə malik zülallar əsasən glialla zəngin M5 və M18 modullarının (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 və GFAP) üzvləridir. Azaldılmış zülallar arasında ən ardıcıl dəyişikliklərə malik olanlar, demək olar ki, yalnız sinapsla əlaqəli M1 modulunun (NPTX2, VGF və RPH3A) üzvləri idi. Biz daha sonra qərb blotlama ilə orta sümük (MDK), CD44, ifraz olunan qıvrımla əlaqəli protein 1 (SFRP1) və VGF-nin AD ilə əlaqəli dəyişikliklərini yoxladıq (Şəkil S3B). Modulun qorunub saxlanması təhlili göstərdi ki, beyin proteomunda olan zülal modullarının təxminən 80%-i (34/44) replikasiya məlumat dəstində əhəmiyyətli dərəcədə qorunub saxlanılıb (z-score> 1.96, FDR korreksiyası P <0.05) (Şəkil S3C). Bu modullardan on dördü iki proteom arasında xüsusi olaraq qorunub saxlanılmışdır (z-score> 10, FDR düzəliş edilmiş P <1.0 × 10−23). Ümumiyyətlə, beyin proteomu arasında diferensial ifadədə və modul tərkibində yüksək dərəcədə ardıcıllığın kəşfi və təkrarlanması AD frontal korteks zülallarında dəyişikliklərin təkrar istehsalını vurğulayır. Bundan əlavə, AsymAD və daha inkişaf etmiş xəstəliklərin çox oxşar beyin şəbəkə quruluşuna sahib olduğunu da təsdiqlədi.
Beyin replikasiyası məlumat dəstindəki diferensial ifadənin daha ətraflı təhlili AsymAD və nəzarət arasında cəmi 151 əhəmiyyətli dərəcədə dəyişmiş zülal daxil olmaqla, AsymAD protein dəyişikliklərinin əhəmiyyətli dərəcəsini vurğulayır (P <0.05) (Şəkil S3D). Amiloid yükü ilə uyğun olaraq, AsymAD və AD-nin beynində APP əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır. MAPT yalnız AD-də əhəmiyyətli dərəcədə dəyişir, bu, artan dolaşıq səviyyələrinə və onun idrak qabiliyyətinin azalması ilə məlum korrelyasiyasına uyğundur (5, 7). Qlial zəngin modullar (M5 və M18) AsymAD-da artan zülallarda yüksək şəkildə əks olunur, neyronla əlaqəli M1 modulu isə AsymAD-da azalmış zülalların ən çox təmsilçisidir. Bu AsymAD markerlərinin çoxu simptomatik xəstəliklərdə daha böyük dəyişiklikləri göstərir. Bu markerlər arasında beyin şişləri və gözlərin və ətrafların inkişafı ilə əlaqəli olan M18-ə aid bir glial protein olan SMOC1 var (32). MDK, M18-in başqa bir üzvü olan hüceyrə böyüməsi və angiogenez (33) ilə əlaqəli heparin bağlayan böyümə faktorudur. Nəzarət qrupu ilə müqayisədə AsymAD əhəmiyyətli dərəcədə artdı, ardınca AD daha çox artdı. Bunun əksinə olaraq, sinaptik protein neyropentraksin 2 (NPTX2) AsymAD beynində əhəmiyyətli dərəcədə azalmışdır. NPTX2 əvvəllər neyrodegenerasiya ilə əlaqəli idi və həyəcanverici sinapsların vasitəçiliyində tanınmış rola malikdir (34). Ümumilikdə, bu nəticələr AD-də xəstəliyin şiddəti ilə irəliləyiş kimi görünən müxtəlif preklinik protein dəyişikliklərini ortaya qoyur.
Beyin proteomunun kəşfində əhəmiyyətli dərəcədə zülal əhatəsinə nail olduğumuzu nəzərə alsaq, onun şəbəkə səviyyəli AD transkriptomu ilə üst-üstə düşməsini daha tam başa düşməyə çalışırıq. Buna görə kəşf etdiyimiz beyin proteomunu AD (n = 308) və nəzarət (n = 157) DLPFC toxumalarında (13) 18,204 genin mikroarray ölçülməsindən əvvəl yaratdığımız modul ilə müqayisə etdik. üst-üstə düşən. Ümumilikdə biz 20 müxtəlif RNT modulunu müəyyən etdik, onların bir çoxu neyronlar, oliqodendrositlər, astrositlər və mikroglia daxil olmaqla xüsusi hüceyrə növlərinin zənginləşməsini nümayiş etdirdi (Şəkil 3A). AD-də bu modulların çoxsaylı dəyişiklikləri Şəkil 3B-də göstərilmişdir. Daha dərin etiketlənməmiş MS proteomundan (təxminən 3000 zülal) (13) istifadə edərək əvvəlki protein-RNT üst-üstə düşmə analizimizə uyğun olaraq, aşkar etdiyimiz beyin proteom şəbəkəsindəki 44 modulun çoxu transkriptom şəbəkəsindədir. Heç bir əhəmiyyətli üst-üstə düşmə yoxdur. kəşfimiz və beyin proteomunda yüksək səviyyədə saxlanılan 34 protein modulunun təkrarlanması, yalnız 14-ü (~40%) Fişerin dəqiq testindən (FET) keçdi, transkriptomla statistik cəhətdən əhəmiyyətli üst-üstə düşdüyünü sübut etdi (Şəkil 3A). DNT zədələnməsinin təmiri (P-M25 və P-M19), zülalların tərcüməsi (P-M7 və P-M20), RNT-nin bağlanması/birləşdirilməsi (P-M16 və P-M21) və protein hədəflənməsi (P-M13 və P-) ilə uyğun gəlir. M23) transkriptomdakı modullarla üst-üstə düşmür. Buna görə də, cari üst-üstə düşmə analizində (13) daha dərin bir proteom məlumat dəsti istifadə edilsə də, AD şəbəkəsi proteomunun çoxu transkriptom şəbəkəsinə uyğunlaşdırılmayıb.
(A) Hipergeometrik FET, AD transkriptomunun (yuxarıda) RNT modulunda hüceyrə tipinə xas markerlərin zənginləşdirilməsini və AD beyninin RNT (x oxu) və protein (y oxu) modulları arasında üst-üstə düşmə dərəcəsini nümayiş etdirir. (aşağı). Qırmızı kölgənin intensivliyi yuxarı paneldəki hüceyrə növlərinin zənginləşmə dərəcəsini və alt paneldəki modulların üst-üstə düşməsinin intensivliyini göstərir. Ulduzlar statistik əhəmiyyəti göstərir (P <0.05). (B) Hər bir transkriptom modulunun xarakterik genləri ilə AD statusu arasında korrelyasiya dərəcəsi. Soldakı modullar AD (mavi) ilə ən mənfi, sağdakılar isə AD (qırmızı) ilə ən müsbət korrelyasiyalıdır. Log-transformasiya edilmiş BH ilə düzəldilmiş P dəyəri hər bir əlaqənin statistik əhəmiyyətinin dərəcəsini göstərir. (C) Paylaşılan hüceyrə tipli zənginləşdirmə ilə əhəmiyyətli üst-üstə düşən modullar. (D) Üst-üstə düşən modulda etiketlənmiş zülalın (x oxu) və RNT (y oxu) log2 qat dəyişməsinin korrelyasiya təhlili. Müvafiq P dəyəri ilə Pearson korrelyasiya əmsalı göstərilir. Mikro, mikroglia; göy cisimləri, astrositlər. CT, nəzarət.
Əksər üst-üstə düşən protein və RNT modulları oxşar hüceyrə tipli zənginləşdirmə profillərini və ardıcıl AD dəyişmə istiqamətlərini bölüşür (Şəkil 3, B və C). Başqa sözlə, beyin proteomunun sinapsla əlaqəli M1 modulu (PM1) AD-də olan üç neyronla zəngin homoloji RNT moduluna (R-M1, R-M9 və R-M16) uyğunlaşdırılıb. aşağı səviyyə. Eynilə, glialla zəngin M5 və M18 zülal modulları astrositlərlə və mikroglial markerlərlə (R-M3, R-M7 və R-M10) zəngin olan RNT modulları ilə üst-üstə düşür və xəstəliklərin artmasında yüksək dərəcədə iştirak edir. İki məlumat dəsti arasında paylaşılan bu modul xüsusiyyətlər beyin proteomunda müşahidə etdiyimiz hüceyrə növünün zənginləşdirilməsini və xəstəliklə bağlı dəyişiklikləri daha da dəstəkləyir. Bununla belə, biz bu paylaşılan modullarda fərdi markerlərin RNT və zülal səviyyələri arasında çoxlu əhəmiyyətli fərqlər müşahidə etdik. Bu üst-üstə düşən modullar daxilində molekulların proteomikası və transkriptomikasının diferensial ifadəsinin korrelyasiya təhlili (Şəkil 3D) bu uyğunsuzluğu vurğulayır. Məsələn, APP və bir neçə digər glial modul zülalları (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 və SFRP1) AD proteomunda əhəmiyyətli artım göstərdi, lakin AD transkriptomunda demək olar ki, heç bir dəyişiklik olmadı. Bu zülala xas dəyişikliklər amiloid lövhələri ilə sıx bağlı ola bilər (23, 35), proteomu patoloji dəyişikliklərin mənbəyi kimi vurğulayır və bu dəyişikliklər transkriptomda əks olunmaya bilər.
Kəşf etdiyimiz beyin və CSF proteomlarını müstəqil təhlil etdikdən sonra, beyin şəbəkəsinin patofiziologiyası ilə əlaqəli AD CSF biomarkerlərini müəyyən etmək üçün iki məlumat dəstinin hərtərəfli təhlilini apardıq. Əvvəlcə iki proteomun üst-üstə düşməsini müəyyənləşdirməliyik. CSF-nin AD beynindəki neyrokimyəvi dəyişiklikləri əks etdirdiyi geniş şəkildə qəbul edilsə də (4), AD beyni ilə CSF proteomu arasında üst-üstə düşmənin dəqiq dərəcəsi aydın deyil. İki proteomumuzda aşkar edilən ortaq gen məhsullarının sayını müqayisə edərək, onurğa-beyin mayesində müəyyən edilmiş zülalların təxminən 70%-nin (n = 1936) beyində də ölçüldüyünü aşkar etdik (Şəkil 4A). Bu üst-üstə düşən zülalların əksəriyyəti (n = 1721) kəşf beyin məlumat dəstindən 44 birgə ifadə modulundan birinə uyğunlaşdırılıb (Şəkil 4B). Gözlənildiyi kimi, altı ən böyük beyin modulu (M1 - M6) ən çox CSF üst-üstə düşür. Bununla belə, daha kiçik beyin modulları (məsələn, M15 və M29) var ki, onlar gözlənilmədən yüksək dərəcədə üst-üstə düşür, beyin modulundan iki dəfə böyükdür. Bu, bizi beyin və onurğa beyni mayesinin üst-üstə düşməsini hesablamaq üçün daha təfərrüatlı, statistikaya əsaslanan metodu qəbul etməyə sövq edir.
(A və B) Kəşf beyin və CSF məlumat dəstlərində aşkar edilən zülallar üst-üstə düşür. Bu üst-üstə düşən zülalların əksəriyyəti beyin birgə ifadə şəbəkəsinin 44 birgə ifadə modulundan biri ilə əlaqələndirilir. (C) Serebrospinal maye proteomu ilə beyin şəbəkəsi proteomu arasında üst-üstə düşməyi kəşf edin. İstilik xəritəsinin hər bir cərgəsi hipergeometrik FET-in ayrıca üst-üstə düşmə analizini təmsil edir. Üst sıra beyin modulu ilə bütün CSF proteomu arasında üst-üstə düşməyi (boz/qara kölgə) təsvir edir. İkinci sətir beyin modulları və CSF proteini (qırmızı rənglə kölgələnmiş) arasındakı üst-üstə düşmənin AD-də əhəmiyyətli dərəcədə yuxarı tənzimləndiyini təsvir edir (P <0.05). Üçüncü sıra beyin modulları və CSF proteini (mavi kölgə) arasındakı üst-üstə düşmənin AD-də əhəmiyyətli dərəcədə aşağı tənzimləndiyini göstərir (P <0.05). FET-dən alınan P dəyərini düzəltmək üçün BH metodundan istifadə edin. (D) Hüceyrə tipli assosiasiyaya və əlaqəli GO şərtlərinə əsaslanan qatlama modul paneli. Bu panellər CSF proteomunda mənalı diferensial ifadəyə malik olan cəmi 271 beyinlə əlaqəli zülaldan ibarətdir.
Tək quyruqlu FET-lərdən istifadə edərək, CSF proteomu və fərdi beyin modulları arasında protein üst-üstə düşməsinin əhəmiyyətini qiymətləndirdik. Təhlil göstərdi ki, CSF məlumat dəstində cəmi 14 beyin modulunun statistik əhəmiyyətli üst-üstə düşmələri (FDR tənzimlənməsi P <0,05) və üst-üstə düşməsi əhəmiyyətə yaxın olan əlavə modulun (M18) (FDR tənzimlənməsi P = 0,06) (Şəkil 4C) , üst sıra). Biz həmçinin diferensial şəkildə ifadə olunan CSF zülalları ilə güclü üst-üstə düşən modullarla maraqlanırıq. Buna görə də, (i) CSF zülalından hansının AD-də əhəmiyyətli dərəcədə artdığını və (ii) CSF proteininin AD-də əhəmiyyətli dərəcədə azaldığını müəyyən etmək üçün iki əlavə FET analizi tətbiq etdik (P <0.05, qoşalaşmış t testi AD/nəzarət) Mənalı üst-üstə düşən beyin modulları onların arasında. Şəkil 4C-nin orta və alt sətirlərində göstərildiyi kimi, bu əlavə təhlillər göstərir ki, 44 beyin modulundan 8-i AD CSF-də əlavə olunan proteinlə (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 və M38) əhəmiyyətli dərəcədə üst-üstə düşür. . ), yalnız iki modul (M6 və M15) AD CSF-də azalmış zülal ilə mənalı üst-üstə düşdüyünü göstərdi. Gözlənildiyi kimi, bütün 10 modul CSF proteomu ilə ən yüksək üst-üstə düşən 15 moduldadır. Buna görə də, bu 15 modulun AD beyindən əldə edilən CSF biomarkerlərinin yüksək məhsuldar mənbələri olduğunu güman edirik.
Biz bu 15 üst-üstə düşən modulları WGCNA ağac diaqramındakı yaxınlığına və hüceyrə növləri və gen ontologiyası ilə əlaqəsinə əsaslanaraq beş böyük protein panelinə qatladıq (Şəkil 4D). Birinci paneldə neyron markerləri və sinapsla əlaqəli zülallarla (M1 və M12) zəngin modullar var. Sinaptik paneldə cəmi 94 zülal var və CSF proteomundakı səviyyələr əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdi və bu, beş panel arasında beyinlə əlaqəli CSF markerlərinin ən böyük mənbəyinə çevrildi. İkinci qrup (M6 və M15) "yaraların sağalması" (M6) və "humoral immun cavabın tənzimlənməsi" (M15) kimi endotel hüceyrəsi markerləri və damar bədəni ilə sıx əlaqəni nümayiş etdirdi. M15 həmçinin endotellə sıx əlaqəli olan lipoprotein metabolizması ilə də yüksək dərəcədə əlaqəlidir (36). Damar panelində beyinlə əlaqəli 34 CSF marker var. Üçüncü qrupa oliqodendrosit markerləri və hüceyrə proliferasiyası ilə əhəmiyyətli dərəcədə bağlı olan modullar (M2 və M4) daxildir. Məsələn, M2-nin yüksək səviyyəli ontoloji terminlərinə “DNT replikasiyasının müsbət tənzimlənməsi” və “purin biosintez prosesi” daxildir. Bu arada, M4-ə "glial hüceyrə diferensiasiyası" və "xromosom seqreqasiyası" daxildir. Miyelinasiya panelində beyinlə əlaqəli 49 CSF marker var.
Dördüncü qrup ən çox modulları (M30, M29, M18, M24 və M5) ehtiva edir və demək olar ki, bütün modullar mikroglia və astrosit markerləri ilə əhəmiyyətli dərəcədə zəngindir. Miyelinasiya panelinə bənzər olaraq, dördüncü panel də hüceyrə proliferasiyası ilə yaxından əlaqəli modulları (M30, M29 və M18) ehtiva edir. Bu qrupdakı digər modullar “immun effekti prosesi” (M5) və “immun reaksiyanın tənzimlənməsi” (M24) kimi immunoloji terminlərlə çox bağlıdır. Qlial immun qrupunda beyinlə əlaqəli 42 CSF marker var. Nəhayət, sonuncu panel dörd modulda (M44, M3, M33 və M38) beyinlə əlaqəli 52 markerdən ibarətdir, bunların hamısı bədəndə enerjinin saxlanması və maddələr mübadiləsi ilə bağlıdır. Bu modulların ən böyüyü (M3) mitoxondriya ilə sıx əlaqəlidir və neyronlara xas markerlərlə zəngindir. M38 bu metabolomun kiçik modul üzvlərindən biridir və eyni zamanda orta neyron spesifikliyi nümayiş etdirir.
Ümumiyyətlə, bu beş panel AD korteksindəki geniş hüceyrə növləri və funksiyalarını əks etdirir və birlikdə beyinlə əlaqəli 271 CSF markerini ehtiva edir (Cədvəl S2G). Bu MS nəticələrinin etibarlılığını qiymətləndirmək üçün biz çoxaltma qabiliyyətinə, yüksək həssaslığa və spesifikliyə malik ortoqonal antikor əsaslı texnologiya olan yaxınlıq uzatma testindən (PEA) istifadə etdik və tapdığımız serebrospinal maye nümunələrini yenidən təhlil etdik. (n = 36). Bu 36 hədəf MS-əsaslı tapıntılarımızla (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12) sıx əlaqəli olan PEA-nın AD çoxluğundakı dəyişikliyi nümayiş etdirir. ).
Beş qrupumuzun vurğuladığı bioloji mövzular, sinaptik siqnaldan tutmuş enerji mübadiləsinə qədər, hamısı AD patogenezi ilə bağlıdır (1-3). Buna görə də, bu panelləri ehtiva edən 15 modulun hamısı kəşf etdiyimiz beyin proteomunda olan AD patologiyası ilə bağlıdır (Şəkil 2B). Ən diqqətəlayiq olanı glial modullarımız arasında yüksək müsbət patoloji korrelyasiya və ən böyük neyron modullarımız (M1 və M3) arasında güclü mənfi patoloji korrelyasiyadır. Təkrarlanan beyin proteomumuzun diferensial ifadə analizi (Şəkil S3D) M5 və M18-dən əldə edilən glial zülalları da vurğulayır. AsymAD və simptomatik AD-də ən çox artan glial zülallar və M1 ilə əlaqəli sinapslar Zülal ən çox azalır. Bu müşahidələr göstərir ki, beş qrupda müəyyən etdiyimiz 271 serebrospinal maye markerləri erkən asemptomatik mərhələlərdə baş verənlər də daxil olmaqla, AD korteksindəki xəstəlik prosesləri ilə əlaqəlidir.
Beyin və onurğa mayesində panel zülallarının dəyişmə istiqamətini daha yaxşı təhlil etmək üçün üst-üstə düşən 15 modulun hər biri üçün aşağıdakıları çəkdik: (i) beyin məlumat dəstində modul bolluğu səviyyəsini və (ii) modul protein Fərq serebrospinal mayedə ifadə edilir (Şəkil S5). Daha əvvəl qeyd edildiyi kimi, WGCNA beyində modul bolluğunu və ya xarakterik protein dəyərini təyin etmək üçün istifadə olunur (13). Vulkan xəritəsi serebrospinal mayedə (AD/nəzarət) modul zülalların diferensial ifadəsini təsvir etmək üçün istifadə olunur. Bu rəqəmlər göstərir ki, beş paneldən üçü beyin və onurğa mayesində fərqli ifadə meyllərini göstərir. Sinaps panelinin iki modulu (M1 və M12) AD beynində bolluq səviyyəsində azalma göstərir, lakin AD CSF-də artan protein ilə əhəmiyyətli dərəcədə üst-üstə düşür (Şəkil S5A). Metabolomu ehtiva edən neyronla əlaqəli modullar (M3 və M38) oxşar beyin və serebrospinal maye ifadə nümunələrinin uyğunsuzluğunu göstərdi (Şəkil S5E). Damar paneli də müxtəlif ifadə meyllərini göstərdi, baxmayaraq ki, modulları (M6 və M15) AD beynində orta dərəcədə artdı və xəstə CSF-də azaldı (Şəkil S5B). Qalan iki paneldə zülalları hər iki bölmədə ardıcıl olaraq yuxarı tənzimlənən böyük qlial şəbəkələr var (Şəkil S5, C və D).
Nəzərə alın ki, bu tendensiyalar bu panellərdəki bütün markerlər üçün ümumi deyil. Məsələn, sinaptik panelə AD beyin və CSF-də əhəmiyyətli dərəcədə azalmış bir neçə zülal daxildir (Şəkil S5A). Bu aşağı tənzimlənən serebrospinal maye markerləri arasında M1-in NPTX2 və VGF və M12-nin xromoqranin B var. Lakin, bu istisnalara baxmayaraq, sinaptik markerlərimizin əksəriyyəti AD onurğa mayesində yüksəlir. Ümumiyyətlə, bu analizlər beş panelimizin hər birində beyin və onurğa beyni maye səviyyələrində statistik əhəmiyyətli meylləri ayırd edə bildi. Bu tendensiyalar AD-də beyin və CSF protein ifadəsi arasındakı mürəkkəb və tez-tez fərqli əlaqəni vurğulayır.
Sonra, 271 biomarker dəstimizi ən perspektivli və təkrarlana bilən hədəflərə qədər daraltmaq üçün yüksək məhsuldarlıqlı MS replikasiya analizindən (CSF replikasiyası 1) istifadə etdik (Şəkil 5A). CSF surəti 1 nəzarət, AsymAD və AD kohortu daxil olmaqla Emory Goizueta ADRC-dən cəmi 96 nümunədən ibarətdir (Cədvəl S1A). Bu AD halları mülayim koqnitiv azalma (ortalama MoCA, 20.0 ± 3.8) və serebrospinal mayedə təsdiqlənmiş AD biomarkerlərində dəyişikliklər (Cədvəl S1A) ilə xarakterizə olunur. Aşkar etdiyimiz CSF analizindən fərqli olaraq, bu replikasiya daha səmərəli və yüksək məhsuldarlığa malik “tək atışlı” MS metodundan (off-line fraksiya olmadan), o cümlədən fərdi nümunələrin immun çatışmazlığına ehtiyacı aradan qaldıran sadələşdirilmiş nümunə hazırlama protokolundan istifadə etməklə həyata keçirilir. . Bunun əvəzinə, daha az zəngin zülalların siqnalını gücləndirmək üçün tək bir immun çatışmazlığı olan "artırma kanalı" istifadə olunur (37). Ümumi proteomun əhatə dairəsini azaltsa da, bu tək atış üsulu maşın vaxtını əhəmiyyətli dərəcədə azaldır və təhlil edilə bilən TMT etiketli nümunələrin sayını artırır (17, 38). Ümumilikdə, təhlil 96 halda 1183 proteomla əlaqələndirilmiş 6487 peptid müəyyən etdi. Tapdığımız CSF analizində olduğu kimi, yalnız nümunələrin ən azı 50%-də ölçülən zülallar sonrakı hesablamalara daxil edildi və məlumatlar yaş və cinsin təsirləri üçün geri çəkildi. Bu, 792 proteomun son kəmiyyətinin müəyyən edilməsinə gətirib çıxardı, onların 95%-i də tapılan CSF məlumat dəstində müəyyən edilib.
(A) Beyinlə əlaqəli CSF protein hədəfləri ilk təkrarlanan CSF kohortunda təsdiqlənmiş və yekun panelə daxil edilmişdir (n = 60). (B-dən E) Dörd CSF replikasiya kohortunda ölçülən panel biomarker səviyyələri (kompozit z-balları). Hər təkrar analizdə bolluqdakı dəyişikliklərin statistik əhəmiyyətini qiymətləndirmək üçün qoşalaşmış t-testləri və ya Tukeyin post-korreksiyası ilə ANOVA istifadə edilmişdir. CT, nəzarət.
Hərtərəfli təhlil vasitəsilə beyinlə əlaqəli 271 CSF hədəfimizi yoxlamaqda xüsusilə maraqlı olduğumuz üçün, biz bu təkrarlanan proteomun əlavə tədqiqini bu markerlərlə məhdudlaşdıracağıq. Bu 271 zülal arasında 100-ü CSF replikasiyası 1-də aşkar edilmişdir. Şəkil S6A nəzarət və AD replikasiya nümunələri arasında üst-üstə düşən bu 100 markerin diferensial ifadəsini göstərir. Sinaptik və metabolit histonları AD-də ən çox artır, damar zülalları isə xəstəlikdə ən çox azalır. 100 üst-üstə düşən markerlərin əksəriyyəti (n = 70) iki məlumat dəstində eyni dəyişiklik istiqamətini saxladı (Şəkil S6B). Bu 70 təsdiqlənmiş beyinlə əlaqəli CSF markerləri (Cədvəl S2H) əsasən daha əvvəl müşahidə olunan panel ifadə tendensiyalarını, yəni damar zülallarının aşağı tənzimlənməsini və bütün digər panellərin yuxarı tənzimlənməsini əks etdirir. Təsdiqlənmiş bu 70 zülaldan yalnız 10-u bu panel tendensiyalarına zidd olan AD bolluğunda dəyişikliklər göstərdi. Beyin və serebrospinal mayenin ümumi tendensiyasını ən yaxşı şəkildə əks etdirən panel yaratmaq üçün biz bu 10 zülalı nəhayət təsdiqlədiyimiz maraq panelindən xaric etdik (Şəkil 5A). Buna görə də, panelimiz müxtəlif nümunə hazırlığı və MS platforma analizindən istifadə edərək iki müstəqil CSF AD kohortunda təsdiqlənmiş cəmi 60 zülaldan ibarətdir. CSF nüsxəsi 1 nəzarətində və AD hallarında bu son panellərin z-hesab ifadə sahələri tapdığımız CSF kohortunda müşahidə olunan panel trendini təsdiqlədi (Şəkil 5B).
Bu 60 zülal arasında AD ilə əlaqəli olduğu bilinən molekullar var, məsələn, bir çox tədqiqatlarda AD ilə əlaqəli olan iltihab əleyhinə sitokin olan osteopontin (SPP1) və sinaptik protein olan GAP43. neyrodegenerasiya ilə açıq şəkildə bağlıdır (42). Ən tam təsdiqlənmiş zülallar amiotrofik yanal skleroz (ALS) ilə əlaqəli superoksid dismutaza 1 (SOD1) və Parkinson xəstəliyi ilə əlaqəli desaxaraza (PARK7) kimi digər neyrodegenerativ xəstəliklərlə əlaqəli markerlərdir. Biz həmçinin SMOC1 və beyinlə zəngin membran əlavə siqnal zülalı 1 (BASP1) kimi bir çox digər markerlərin neyrodegenerasiya ilə əvvəlki əlaqələrini məhdudlaşdırdığını təsdiq etdik. Qeyd etmək lazımdır ki, onların CSF proteomunda ümumi bolluğu az olduğuna görə, MAPT və bəzi digər AD ilə əlaqəli zülalları (məsələn, NEFL və NRGN) etibarlı şəkildə aşkar etmək üçün bu yüksək məhsuldarlıqlı tək vuruşlu aşkarlama metodundan istifadə etmək bizim üçün çətindir. ) ( 43, 44).
Daha sonra bu 60 prioritet panel markerini üç əlavə təkrar analizdə yoxladıq. CSF Copy 2-də biz Emory Goizueta ADRC-dən (17) 297 nəzarət və AD nümunələrindən ibarət müstəqil kohortu təhlil etmək üçün tək TMT-MS-dən istifadə etdik. CSF replikasiyası 3, İsveçrənin Lozannasından olan 120 nəzarət və AD xəstələrindən əldə edilən mövcud TMT-MS məlumatlarının yenidən təhlilini əhatə etdi (45). Hər bir verilənlər bazasında 60 prioritet markerin üçdə ikisindən çoxunu aşkar etdik. İsveçrə tədqiqatı müxtəlif MS platformalarından və TMT kəmiyyət üsullarından istifadə etsə də (45, 46), biz panel tendensiyalarımızı iki təkrar analizdə (Şəkil 5, C və D və Cədvəl S2, I və J) güclü şəkildə təkrarladıq. Qrupumuzun xəstəliyin spesifikliyini qiymətləndirmək üçün biz yalnız nəzarət (n = 18) və AD (n = 17) hallarını deyil, həm də PD (n = 17) olan dördüncü replikasiya məlumat dəstini (CSF replikasiyası 4) təhlil etmək üçün TMT-MS-dən istifadə etdik. n = 14)), ALS (n = 18) və frontotemporal demans (FTD) nümunələri (n = 11) (Cədvəl S1A). Bu kohortdakı panel zülallarının təxminən üçdə ikisini müvəffəqiyyətlə ölçdük (60-dan 38-i). Bu nəticələr bütün beş biomarker panellərində AD-yə xas dəyişiklikləri vurğulayır (Şəkil 5E və Cədvəl S2K). Metabolit qrupunda artım ən güclü AD spesifikliyini, sonra miyelinasiya və glial qrupunu göstərdi. Daha az dərəcədə, FTD də bu panellər arasında artım göstərir ki, bu da oxşar potensial şəbəkə dəyişikliklərini əks etdirə bilər (17). Bunun əksinə olaraq, ALS və PD nəzarət qrupu ilə demək olar ki, eyni miyelinasiya, glial və metabolom profillərini göstərdi. Ümumilikdə, nümunənin hazırlanması, MS platforması və TMT kəmiyyət üsullarında fərqlərə baxmayaraq, bu təkrar təhlillər göstərir ki, bizim prioritet panel markerlərimiz 500-dən çox unikal CSF nümunəsində yüksək ardıcıl AD-yə xas dəyişikliklərə malikdir.
AD neyrodegenerasiyası koqnitiv simptomların başlamasından bir neçə il əvvəl geniş şəkildə tanınıb, buna görə də AsymAD biomarkerlərinə təcili ehtiyac var (5, 31). Bununla belə, getdikcə daha çox sübut AsymAD-ın biologiyasının homojenlikdən uzaq olduğunu və risk və davamlılığın kompleks qarşılıqlı əlaqəsi xəstəliyin sonrakı inkişafında böyük fərdi fərqlərə səbəb olduğunu göstərir (47). AsymAD hallarını müəyyən etmək üçün istifadə olunsa da, əsas CSF biomarkerlərinin səviyyələri (Aβ1-42, total tau və p-tau) kimin demensiyaya doğru irəliləyəcəyini etibarlı şəkildə proqnozlaşdıra bilməsi sübuta yetirilməmişdir (4, 7), daha çox ola bilər. Bu əhalinin riskini dəqiq şəkildə stratifikasiya etmək üçün beyin fiziologiyasının çoxsaylı aspektlərinə əsaslanan vahid biomarker alətlərini daxil etmək lazımdır. Buna görə də, biz sonradan CSF surəti 1-in AsymAD populyasiyasında AD ilə təsdiqlənmiş biomarker panelimizi təhlil etdik. Bu 31 AsymAD hadisəsi anormal əsas biomarker səviyyələrini (Aβ1–42/total tau ELISA nisbəti, <5.5) və tam idrak (ortalama MoCA, 27.1) göstərdi. ± 2.2) (Cədvəl S1A). Bundan əlavə, AsymAD olan bütün fərdlərin 0-a bərabər klinik demans balı var ki, bu da gündəlik koqnitiv və ya funksional performansın azalmasına dair heç bir dəlil olmadığını göstərir.
Biz əvvəlcə AsymAD kohortu da daxil olmaqla bütün 96 CSF replikasının 1-də təsdiqlənmiş panellərin səviyyələrini təhlil etdik. AsymAD qrupundakı bir neçə panelin əhəmiyyətli AD kimi bolluq dəyişikliyinə malik olduğunu, damar panelinin AsymAD-da aşağıya doğru meyl göstərdiyini, bütün digər panellərin isə yüksəliş tendensiyası göstərdiyini aşkar etdik (Şəkil 6A). Buna görə də, bütün panellər ELISA Aβ1-42 və ümumi tau səviyyələri ilə yüksək əhəmiyyətli korrelyasiya göstərdi (Şəkil 6B). Bunun əksinə olaraq, qrup və MoCA balı arasında korrelyasiya nisbətən zəifdir. Bu təhlillərin daha diqqətəlayiq tapıntılarından biri AsymAD kohortunda panel bolluğunun geniş diapazonudur. Şəkil 6A-da göstərildiyi kimi, AsymAD qrupunun panel səviyyəsi adətən nəzarət qrupu və AD qrupunun panel səviyyəsini kəsir və nisbətən yüksək dəyişkənlik göstərir. AsymAD-ın bu heterojenliyini daha da araşdırmaq üçün çoxölçülü Ölçmə (MDS) analizini 96 CSF replikasiyası 1 vəziyyətinə tətbiq etdik. MDS təhlili verilənlər toplusunda müəyyən dəyişənlər əsasında hallar arasında oxşarlığı vizuallaşdırmağa imkan verir. Bu klaster təhlili üçün biz yalnız CSF kəşfi və replikasiya 1 proteomu (n = 29) (Cədvəl S2L) səviyyəsində statistik əhəmiyyətli dəyişikliyə (P <0.05, AD/nəzarət) malik olan təsdiqlənmiş panel markerlərindən istifadə edirik. Bu təhlil bizim nəzarətimizlə AD halları arasında aydın məkan qruplaşması yaratdı (Şəkil 6C). Bunun əksinə olaraq, bəzi AsymAD halları nəzarət qrupunda, digərləri isə AD vəziyyətlərində yerləşir. Bu AsymAD heterojenliyini daha da araşdırmaq üçün biz bu AsymAD hallarının iki qrupunu müəyyən etmək üçün MDS xəritəmizdən istifadə etdik. Birinci qrupa nəzarətə daha yaxın olan AsymAD halları (n = 19), ikinci qrup isə AD-yə daha yaxın marker profili olan AsymAD halları ilə xarakterizə olunurdu (n = 12).
(A) AsymAD daxil olmaqla, CSF replikasiya 1 kohortunda bütün 96 nümunədə CSF biomarker qrupunun ifadə səviyyəsi (z-balı). Panel bolluğu dəyişikliklərinin statistik əhəmiyyətini qiymətləndirmək üçün Tukeyin post-korreksiyası ilə dispersiya təhlilindən istifadə edilmişdir. (B) ELISA Aβ1-42 və CSF surəti 1 nümunələrində MoCA hesabı və ümumi tau səviyyəsi ilə panel zülal bolluğu səviyyəsinin (z-balı) korrelyasiya təhlili. Müvafiq P dəyəri ilə Pearson korrelyasiya əmsalı göstərilir. (C) 96 CSF surəti 1 halının MDS-i həm kəşf, həm də CSF surəti 1 məlumat dəstlərində əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdirilmiş 29 təsdiqlənmiş panel markerinin bolluq səviyyələrinə əsaslanırdı [P <0.05 AD/nəzarət (CT)]. Bu analiz AsymAD qrupunu nəzarət (n = 19) və AD (n = 12) alt qruplarına bölmək üçün istifadə edilmişdir. (D) Vulkan süjeti iki AsymAD altqrupu arasında -log10 statistik P dəyərinə nisbətən log2 qat dəyişməsi (x oxu) ilə bütün CSF replikasiya 1 zülallarının diferensial ifadəsini göstərir. Panel biomarkerləri rənglidir. (E) CSF replikasiyası Seçim qrupu biomarkerlərinin 1 bolluq səviyyəsi AsymAD alt qrupları arasında diferensial şəkildə ifadə edilir. Statistik əhəmiyyəti qiymətləndirmək üçün Tukey-nin düzəlişdən sonra dispersiya təhlilindən istifadə edilmişdir.
Bu nəzarət və AD kimi AsymAD halları arasında diferensial protein ifadəsini araşdırdıq (Şəkil 6D və Cədvəl S2L). Yaranan vulkan xəritəsi göstərir ki, 14 panel işarəsi iki qrup arasında əhəmiyyətli dərəcədə dəyişib. Bu markerlərin əksəriyyəti sinaps və metabolomun üzvləridir. Bununla belə, müvafiq olaraq miyelin və glial immun qruplarının üzvləri olan SOD1 və miristollaşdırılmış alaninlə zəngin protein kinaz C substratı (MARCKS) də bu qrupa aiddir (Şəkil 6, D və E). Damar paneli, həmçinin AE bağlayıcı protein 1 (AEBP1) və tamamlayıcı ailə üzvü C9 daxil olmaqla, AD-yə bənzər AsymAD qrupunda əhəmiyyətli dərəcədə azalmış iki markerə töhfə verdi. ELISA AB1-42 (P = 0.38) və p-tau (P = 0.28)-də nəzarət və AD kimi AsymAD alt qrupları arasında əhəmiyyətli fərq yox idi, lakin ümumi tau səviyyəsində həqiqətən əhəmiyyətli bir fərq var idi (P = 0.0031). ) (Şəkil S7). İki AsymAD altqrupu arasındakı dəyişikliklərin ümumi tau səviyyələrindən (məsələn, YWHAZ, SOD1 və MDH1) daha əhəmiyyətli olduğunu göstərən bir neçə panel markeri var (Şəkil 6E). Ümumilikdə, bu nəticələr göstərir ki, təsdiqlənmiş panelimiz asemptomatik xəstəliyi olan xəstələrin alt tiplərini və potensial risk təbəqələrini təyin edə bilən biomarkerləri ehtiva edə bilər.
AD-nin arxasında olan müxtəlif patofiziologiyanı daha yaxşı ölçmək və hədəfləmək üçün sistem əsaslı biomarker alətlərinə təcili ehtiyac var. Bu vasitələrin təkcə AD diaqnostik çərçivəmizi dəyişdirməsi deyil, həm də effektiv, xəstəyə xas müalicə strategiyalarının qəbulunu təşviq etməsi gözlənilir (1, 2). Bu məqsədlə, geniş spektrli beyin əsaslı patofiziologiyanı əks etdirən veb əsaslı CSF biomarkerlərini müəyyən etmək üçün AD beyni və CSF-ə qərəzsiz hərtərəfli proteomik yanaşma tətbiq etdik. Bizim təhlilimiz beş CSF biomarker paneli istehsal etdi, bunlar (i) sinapsları, qan damarlarını, mielini, immun və metabolik disfunksiyanı əks etdirir; (ii) müxtəlif MS platformalarında güclü reproduktivlik nümayiş etdirmək; (iii) AD-nin erkən və gec mərhələlərində mütərəqqi xəstəliyə xas dəyişiklikləri göstərin. Ümumilikdə, bu tapıntılar AD tədqiqatı və klinik tətbiqlər üçün müxtəlif, etibarlı, veb yönümlü biomarker vasitələrinin inkişafı istiqamətində perspektivli bir addımdır.
Nəticələrimiz AD beyin şəbəkəsi proteomunun yüksək dərəcədə qorunmuş təşkilini nümayiş etdirir və onun sistem əsaslı biomarker inkişafı üçün lövbər kimi istifadəsini dəstəkləyir. Təhlillərimiz göstərir ki, AD və AsymAD beyinlərini ehtiva edən iki müstəqil TMT-MS verilənlər bazası güclü modulluğa malikdir. Bu tapıntılar əvvəlki işimizi genişləndirərək, frontal, parietal və temporal korteksdəki çoxsaylı müstəqil kohortlardan 2000-dən çox beyin toxumasının güclü modullarının qorunduğunu nümayiş etdirir (17). Bu konsensus şəbəkəsi, qlialla zəngin iltihab modullarının artması və neyronla zəngin modulların azalması da daxil olmaqla, mövcud tədqiqatda müşahidə edilən müxtəlif xəstəliklərlə bağlı dəyişiklikləri əks etdirir. Cari tədqiqat kimi, bu geniş miqyaslı şəbəkə AsymAD-da müxtəlif preklinik patofiziologiyanı göstərən əhəmiyyətli modul dəyişikliklərə malikdir (17).
Bununla belə, bu yüksək mühafizəkar sistemə əsaslanan çərçivə daxilində, xüsusən də AD-nin erkən mərhələlərində olan fərdlər arasında daha incə dənəli bioloji heterojenlik var. Bizim biomarker panelimiz AsymAD-da çoxsaylı CSF markerlərinin əhəmiyyətli diferensial ifadəsini nümayiş etdirən iki alt qrupu təsvir edə bilir. Qrupumuz bu iki alt qrup arasında əsas AD biomarkerləri səviyyəsində aşkar olmayan bioloji fərqləri vurğulaya bildi. Nəzarət qrupu ilə müqayisədə bu AsymAD fərdlərinin Aβ1-42/cəmi tau nisbətləri anormal dərəcədə aşağı idi. Bununla belə, yalnız ümumi tau səviyyələri iki AsymAD altqrupu arasında əhəmiyyətli dərəcədə fərqli idi, Aβ1-42 və p-tau səviyyələri isə nisbətən müqayisəli olaraq qaldı. Yüksək CSF tau Aβ1-42 səviyyələrindən (7) daha yaxşı bilişsel simptomların proqnozlaşdırıcısı kimi göründüyündən, iki AsymAD kohortunun xəstəliyin irəliləməsi üçün fərqli risklərə malik ola biləcəyindən şübhələnirik. AsymAD-ın məhdud seçmə ölçüsünü və uzununa məlumatların olmadığını nəzərə alaraq, bu nəticələri inamla çıxarmaq üçün əlavə tədqiqatlara ehtiyac var. Bununla belə, bu nəticələr sistem əsaslı CSF panelinin xəstəliyin asemptomatik mərhələsində fərdləri effektiv şəkildə təbəqələşdirmək qabiliyyətimizi artıra biləcəyini göstərir.
Ümumiyyətlə, tapıntılarımız AD patogenezində çoxsaylı bioloji funksiyaların rolunu dəstəkləyir. Bununla belə, nizamlanmamış enerji mübadiləsi bütün təsdiqlənmiş beş etiket panelimizin əsas mövzusuna çevrildi. Hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaza 1 (HPRT1) və laktat dehidrogenaz A (LDHA) kimi metabolik zülallar, AD CSF-də artımın yüksək dərəcədə təkrarlanan cinsiyyət olduğunu göstərən ən etibarlı şəkildə təsdiqlənmiş sinaptik biomarkerlərdir. Qan damarlarımızda və glial panellərimizdə oksidləşdirici maddələrin mübadiləsində iştirak edən bir neçə marker də var. Bu tapıntılar, metabolik proseslərin təkcə neyronların yüksək enerji tələbatını ödəmək üçün deyil, həm də astrositlərin və digər glial hüceyrələrin yüksək enerji tələbatını ödəmək üçün bütün beyində oynadığı əsas rola uyğundur (17, 48). Nəticələrimiz redoks potensialındakı dəyişikliklərin və enerji yollarının kəsilməsinin mitoxondrial pozğunluqlar, qlial vasitəli iltihab və Damar zədələnməsi daxil olmaqla, AD patogenezində iştirak edən bir neçə əsas proseslər arasında əsas əlaqə ola biləcəyinə dair artan sübutları dəstəkləyir (49). Bundan əlavə, metabolik serebrospinal maye biomarkerləri bizim nəzarətimiz və AD-yə bənzər AsymAD alt qrupları arasında çoxlu sayda fərqli zəngin zülal ehtiva edir ki, bu enerji və redoks yollarının pozulması xəstəliyin preklinik mərhələsində kritik ola bilər.
Müşahidə etdiyimiz fərqli beyin və serebrospinal maye panel tendensiyalarının da maraqlı bioloji təsirləri var. Neyronlarla zəngin olan sinapslar və metabolomlar AD beynində səviyyələrin azaldığını və serebrospinal mayenin bolluğunun artdığını göstərir. Neyronların çoxsaylı xüsusi siqnalları üçün enerji təmin etmək üçün sinapslarda enerji istehsal edən mitoxondriyalarla zəngin olduğunu nəzərə alsaq (50), bu iki neyron qrupunun ifadə profillərinin oxşarlığı gözlənilir. Neyronların itirilməsi və zədələnmiş hüceyrələrin ekstruziyası sonrakı xəstəliklərdə bu beyin və CSF panel meyllərini izah edə bilər, lakin müşahidə etdiyimiz erkən panel dəyişikliklərini izah edə bilməz (13). Erkən asemptomatik xəstəlikdə bu tapıntıların mümkün izahı anormal sinaptik budamadır. Siçan modellərindəki yeni dəlillər göstərir ki, mikroglia ilə əlaqəli sinaptik faqositoz AD-də anormal şəkildə aktivləşə bilər və beyində erkən sinaps itkisinə səbəb ola bilər (51). Bu atılmış sinaptik material CSF-də toplana bilər, buna görə də biz neyron panelində CSF artımını müşahidə edirik. İmmun vasitəli sinaptik budama, xəstəlik prosesi boyunca beyində və onurğa beyni mayesində müşahidə etdiyimiz glial zülalların artımını da qismən izah edə bilər. Sinaptik budama ilə yanaşı, ekzositik yolda ümumi anormallıqlar da neyron markerlərinin müxtəlif beyin və CSF ifadələrinə səbəb ola bilər. Bir sıra tədqiqatlar göstərir ki, AD beynin patogenezində ekzosomların məzmunu dəyişmişdir (52). Hüceyrədənkənar yol da Aβ-nin yayılmasında iştirak edir (53, 54). Qeyd etmək lazımdır ki, ekzosomal sekresiyanın bastırılması AD transgenik siçan modellərində AD kimi patologiyanı azalda bilər (55).
Eyni zamanda, damar panelindəki zülal AD beyinində orta dərəcədə artım göstərdi, lakin CSF-də əhəmiyyətli dərəcədə azaldı. Qan-beyin baryerinin (BBB) disfunksiyası bu tapıntıları qismən izah edə bilər. Bir çox müstəqil postmortem insan tədqiqatları AD-də BBB parçalanmasını nümayiş etdirdi (56, 57). Bu tədqiqatlar beyin kapilyarlarının sızması və qanla ötürülən zülalların perivaskulyar yığılması da daxil olmaqla, bu sıx möhürlənmiş endotel hüceyrələri təbəqəsini əhatə edən müxtəlif anormal fəaliyyətləri təsdiqlədi (57). Bu, beyindəki yüksək damar zülalları üçün sadə bir izahat verə bilər, lakin bu eyni zülalların serebrospinal mayedə tükənməsini tam izah edə bilməz. Bir ehtimal, mərkəzi sinir sisteminin artan iltihab və oksidləşdirici stress problemini həll etmək üçün bu molekulları aktiv şəkildə təcrid etməsidir. Bu paneldəki bəzi ən ağır CSF zülallarının, xüsusən də lipoprotein tənzimlənməsində iştirak edənlərin azalması, iltihabın zərərli səviyyələrinin və reaktiv oksigen növlərinin nöroprotektiv prosesinin inhibə edilməsi ilə əlaqədardır. Bu, qan dövranında oksidləşdirici stress səviyyələrini azaltmaqdan məsul olan lipoprotein bağlayan ferment olan Paroksonaz 1 (PON1) üçün doğrudur (58, 59). Alfa-1-mikroqlobulin/bikunin prekursoru (AMBP) damar qrupunun digər əhəmiyyətli dərəcədə aşağı tənzimlənən markeridir. O, iltihabın yatırılmasında və nevroloji qorumada da iştirak edən lipid daşıyıcı bikuninin xəbərçisidir (60, 61).
Müxtəlif maraqlı fərziyyələrə baxmayaraq, biokimyəvi xəstəlik mexanizmlərini birbaşa aşkar edə bilməmək kəşfə əsaslanan proteomik analizin tanınmış məhdudiyyətidir. Buna görə də, bu biomarker panellərinin arxasındakı mexanizmləri inamla müəyyən etmək üçün əlavə tədqiqatlar lazımdır. MS əsaslı klinik analizin inkişafına doğru irəliləmək üçün gələcək istiqamət həm də seçici və ya paralel reaksiya monitorinqi kimi genişmiqyaslı biomarkerlərin yoxlanılması üçün məqsədyönlü kəmiyyət üsullarının istifadəsini tələb edir (62). Biz bu yaxınlarda burada təsvir edilən CSF protein dəyişikliklərinin çoxunu təsdiqləmək üçün paralel reaksiya monitorinqindən (63) istifadə etdik. YWHAZ, ALDOA və SMOC1 daxil olmaqla, bir neçə prioritet panel hədəfləri əhəmiyyətli dəqiqliklə ölçüldü, bu da müvafiq olaraq sinaps, metabolizm və iltihab panellərimizə uyğundur (63). Müstəqil Məlumatların Alınması (DIA) və digər MS əsaslı strategiyalar da hədəfin yoxlanılması üçün faydalı ola bilər. Bud və başqaları. (64) Bu yaxınlarda nümayiş etdirildi ki, CSF kəşf məlumat dəstimizdə müəyyən edilmiş AD biomarkerləri ilə üç müxtəlif Avropa kohortundan 200-ə yaxın CSF nümunəsindən ibarət müstəqil DIA-MS məlumat dəsti arasında əhəmiyyətli üst-üstə düşür. Bu son tədqiqatlar panellərimizin etibarlı MS əsaslı aşkarlamaya çevrilmə potensialını dəstəkləyir. Ənənəvi antikor və aptamer əsaslı aşkarlama əsas AD biomarkerlərinin gələcək inkişafı üçün də vacibdir. CSF-nin az bolluğuna görə, yüksək məhsuldarlıqlı MS metodlarından istifadə edərək bu biomarkerləri aşkar etmək daha çətindir. NEFL və NRGN, hərtərəfli təhlilimizdə panelə uyğunlaşdırılan, lakin vahid MS strategiyamızdan istifadə etməklə etibarlı şəkildə aşkarlana bilməyən, az miqdarda CSF biomarkerlərinin iki belə nümunəsidir. PEA kimi çoxsaylı antikorlara əsaslanan hədəfləmə strategiyaları bu markerlərin klinik transformasiyasını təşviq edə bilər.
Ümumiyyətlə, bu tədqiqat müxtəlif sistemlərə əsaslanan CSF AD biomarkerlərinin identifikasiyası və yoxlanılması üçün unikal proteomik yanaşma təqdim edir. Əlavə AD kohortları və MS platformalarında bu marker panellərinin optimallaşdırılması AD riskinin təbəqələşməsini və müalicəsini inkişaf etdirmək üçün ümidverici ola bilər. Zamanla bu panellərin uzununa səviyyəsini qiymətləndirən tədqiqatlar, erkən xəstəlik riskini və xəstəliyin şiddətindəki dəyişiklikləri ən yaxşı şəkildə stratifikasiya edən markerlərin hansı birləşməsini müəyyən etmək üçün də vacibdir.
CSF tərəfindən kopyalanan 3 nümunə istisna olmaqla, bu tədqiqatda istifadə edilən bütün CSF nümunələri Emory ADRC və ya yaxından əlaqəli tədqiqat institutlarının himayəsi altında toplanmışdır. Bu proteomik tədqiqatlarda cəmi dörd dəst Emory CSF nümunəsi istifadə edilmişdir. CSF kohortunda 20 sağlam nəzarət və 20 AD xəstəsindən nümunələr olduğu aşkar edildi. CSF 1-ci nüsxəyə 32 sağlam nəzarət, 31 AsymAD fərd və 33 AD fərdindən nümunələr daxildir. CSF surəti 2-də 147 nəzarət və 150 AD nümunəsi var. Çox xəstəlikli CSF replikasiyası 4 kohorta 18 nəzarət, 17 AD, 19 ALS, 13 PD və 11 FTD nümunəsi daxildir. Emory Universitetinin İnstitusional Nəzarət Şurası tərəfindən təsdiq edilmiş razılaşmaya əsasən, Emory tədqiqatının bütün iştirakçıları məlumatlı razılıq əldə etdilər. Alzheimer Mərkəzləri üçün 2014-cü il Milli Yaşlanma Ən Yaxşı Təcrübə Təlimatlarına (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) uyğun olaraq, onurğa beyni mayesi lomber ponksiyonla toplanmış və saxlanılmışdır. Nəzarət və AsymAD və AD xəstələri Emory Koqnitiv Nevrologiya Klinikasında və ya Goizueta ADRC-də standartlaşdırılmış idrak qiymətləndirməsi aldılar. Onların serebrospinal maye nümunələri ELISA Aβ1-42, total tau və p-tau analizi (65) üçün INNO-BIA AlzBio3 Luminex tərəfindən sınaqdan keçirilmişdir. ELISA dəyərləri müəyyən edilmiş AD biomarker kəsmə meyarlarına əsaslanan subyektlərin diaqnostik təsnifatını dəstəkləmək üçün istifadə olunur (66, 67). Digər CSF diaqnozları (FTD, ALS və PD) üçün əsas demoqrafik və diaqnostik məlumatlar da Emory ADRC və ya əlaqəli tədqiqat institutlarından əldə edilir. Bu Emory CSF halları üçün xülasə hal metadatasını Cədvəl S1A-da tapa bilərsiniz. İsveçrə CSF replikasiya 3 kohortunun xüsusiyyətləri əvvəllər dərc edilmişdir (45).
CSF nümunəni tapdı. CSF məlumat dəstini kəşfimizin dərinliyini artırmaq üçün tripsinizasiyadan əvvəl yüksək bolluqlu zülalların immun istehlakı aparıldı. Qısacası, 40 fərdi CSF nümunəsindən 130 μl CSF və bərabər həcmdə (130 μl) High Select Top14 Bol Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) spin sütununa (Thermo Fisher Scientific, A89868) yerləşdirildi. temperatur İnkubasiya). 15 dəqiqə döndərdikdən sonra nümunəni 1000 q-da 2 dəqiqə sentrifuqa edin. 3K ultramərkəzdənqaçma filtr cihazından (Millipore, UFC500396) 30 dəqiqə ərzində 14,000 q-da sentrifuqa etməklə tullantı nümunəsini konsentrasiya etmək üçün istifadə edilmişdir. Bütün nümunə həcmlərini fosfat tamponlu salin ilə 75 μl-ə qədər seyreltin. Protein konsentrasiyası istehsalçının protokoluna (Thermo Fisher Scientific) uyğun olaraq bicinchoninic acid (BCA) üsulu ilə qiymətləndirilmişdir. Bütün 40 nümunədən immun çatışmazlığı olan CSF (60 μl) lizil endopeptidaza (LysC) və tripsin ilə həzm olundu. Bir sözlə, nümunə azaldılmış və 1,2 μl 0,5 M tris-2(-karboksietil)-fosfin və 3 μl 0,8 M xloroasetamid ilə 90°C-də 10 dəqiqə alkilləşdirilmiş və sonra 15 dəqiqə su hamamında sonikasiya edilmişdir. Nümunə 193 μl 8 M karbamid tamponu [8 M karbamid və 100 mM NaHPO4 (pH 8.5)] ilə 6 M karbamidin son konsentrasiyasına qədər seyreltildi. LysC (4,5 μg; Wako) otaq temperaturunda bir gecədə həzm üçün istifadə olunur. Sonra nümunə 50 mM ammonium bikarbonat (ABC) ilə 1 M karbamid qədər seyreltildi (68). Bərabər miqdarda (4,5 mkq) tripsin (Promeqa) əlavə edin və sonra nümunəni 12 saat inkubasiya edin. Həzm olunan peptid məhlulunu 1% qarışqa turşusu (FA) və 0,1% trifluoroasetik turşu (TFA) (66) son konsentrasiyasına qədər turşulaşdırın və sonra yuxarıda göstərildiyi kimi 50 mq Sep-Pak C18 sütunu (Sular) ilə duzsuzlaşdırın (25) . Sonra peptid 1 ml 50% asetonitrildə (ACN) elüt edildi. Partiyalar arasında zülalın kəmiyyətini standartlaşdırmaq üçün (25), bütün 40 CSF nümunəsindən 100 μl alikot qarışıq nümunə yaratmaq üçün birləşdirildi, daha sonra beş qlobal daxili standart (GIS) (48) nümunəyə bölündü. Bütün fərdi nümunələr və birləşdirilmiş standartlar yüksək sürətli vakuumla (Labconco) qurudulur.
CSF nümunəni kopyalayır. Dayon və həmkarları daha əvvəl immun çatışmazlığı və CSF surətinin 3 nümunəsinin həzmini təsvir etmişdilər (45, 46). Qalan təkrar nümunələr fərdi olaraq immun çatışmazlığına məruz qalmamışdır. Bu çıxarılmamış nümunələri daha əvvəl təsvir edildiyi kimi tripsində həzm edin (17). Hər təkrar analiz üçün hər bir nümunədən 120 μl elüsiya edilmiş peptid alikotları bir araya toplanmış və TMT etiketli qlobal daxili standart kimi istifadə edilmək üçün bərabər həcmli alikotlara bölünmüşdür (48). Bütün fərdi nümunələr və birləşdirilmiş standartlar yüksək sürətli vakuumla (Labconco) qurudulur. Aşağı bolluqlu CSF zülalının siqnalını gücləndirmək üçün hər bir nümunədən 125 μl birləşdirərək, hər bir təkrar analiz üçün “təkmilləşdirilmiş” nümunə hazırlanmışdır [yəni, tədqiqat nümunəsini təqlid edən bioloji nümunə, lakin mövcud miqdar daha böyük (37, 69)] qarışıq CSF nümunəsinə birləşdi (17). Qarışıq nümunə daha sonra 12 ml High Select Top14 Bol Zülal Çıxarıcı Qatrandan (Thermo Fisher Scientific, A36372) istifadə edilərək immunoremissiya edilib, yuxarıda təsvir olunduğu kimi həzm edilib və sonrakı çoxsaylı TMT etiketlənməsinə daxil edilib.
Göndərmə vaxtı: 27 avqust 2021-ci il